マクロファージの食作用能力に対するアスピリンとイブプロフェンの効果

要約

このビデオでは、pH感受性蛍光色素染色真菌細胞を使用して、アスピリンとイブプロフェンがマクロファージ食作用に対する最小阻害濃度での影響を評価する方法を紹介しています。これらの薬剤はシクロオキシゲナーゼ-2を阻害し、プロスタグランジン形成を減少させ、マクロファージ食作用を促進することが、pH感受性色素の蛍光測定で観察されます。

プロトコル

>1. 安全上の考慮事項

1. 人員は個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。
2. 病原体とマクロファージは、クラスIIの生物学的安全キャビネットで取り扱います。

2. マクロファージの調製

1. 10 mL の Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) 培地に 20 mg/mL ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、20 U/mL ペニシリン、および 10% ウシ胎児血清 (FBS) を添加した組織フラスコで、マウスマクロファージ細胞株 RAW 264.7 を培養します。
2. フラスコを37°Cに設定した5%二酸化炭素(CO₂)インキュベーターに80%のコンフルエントに達するまで置きます。
3. セルスクレーパーを使用して細胞をそっとこすり落とします。
4. 懸濁した細胞を15 mLの遠心チューブに移します。
5. トリパンブルー染色剤を使用して、細胞の生存率を判断します。
   手記：生存率スコアが85%を超えることが望ましいです
   血球計算盤を使用して、新鮮な滅菌済み RPMI-1640 培地の 10 mL 溶液を使用して、マクロファージの細胞濃度を 1 × 10⁵ cells/mL に調整します。細胞の懸濁液 100 μL を滅菌済み 96 ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルに分注します。プレートを5%_CO2インキュベーターで37°C.
   で一晩インキュベートします。 手記：一晩使用した培地は吸引し、使用前に100 μLの新鮮で滅菌済みのRPMI-1640培地と交換する必要があります。

3. クリプトコッカス細胞の調製

1. 滅菌酵母-麦芽抽出物(YM)寒天プレートに接種ループで試験生物をストリークアウトします。
2. 寒天プレートを30°Cで48時間インキュベートします。
3. 接種ループを使用して、ループ状の細胞を100 mLの酵母窒素塩基(YNB)ブロスに4%グルコースを添加して接種します。
4. 細胞を160rpm、30°Cで振とうしながら一晩増殖させます(培養前)。
5. 翌日、0.1 mLのプレカルチャーを新鮮なYNBブロスに接種し(メインカルチャー)、細胞を中指数フェーズまで増殖させます(同じ培養条件下で)。
6. 細胞をリン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄します。
7. 血球計算盤を使用して、細胞をPBSで1 x 10⁵に標準化します。

4. クリプトコッカス細胞の食作用染色による

染色

1. 999 μLの細胞を1.5 mLのプラスチックチューブに分注します。
2. pHrodoグリーンザイモサンA染色液1 μLを同じチューブに加えます。
3. 細胞を室温で1時間、暗所でゆっくりと攪拌しながらインキュベートし、染色と反応させます。
4. インキュベーション期間の終わりに、PBSで細胞を3回洗浄します。
5. 100 μLの細胞懸濁液を、播種したマクロファージを含むウェルに分注します。

5. 薬の調製

1. 1000 mLの無水エタノールに1 mgのアスピリンを使用して、最終濃度1000 μg / mLのアスピリン原液を調製します。
2. RPMI-1640培地で化合物をさらに希釈して、目的の薬物濃度にします
   手記： RPMI-1640培地中のエタノールの最終量は、決して1%を超えてはなりません。1000mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に1mgのイブプロフェンを使用してイブプロフェンの原液を調製します。RPMI-1640培地で化合物をさらに希釈して、目的の薬物濃度に到達します。
   手記： RPMI-1640 メディアの DMSO の最終量は 1% を超えてはなりません。調製した薬剤の100 μL溶液を所望の4倍の濃度で調製し、播種したマクロファージおよびクリプトコッカス細胞を含む適切なウェルに分注します。

>6. マクロファージ食作用に対する化学感作剤の効果

1. 5% CO₂インキュベーター内の5% CO 2インキュベーターで、化学増感剤、アスピリン、またはイブプロフェンの存在下で、共培養細胞とプレートを2時間または6時間インキュベー
トします。
2. インキュベーション期間の終了時に、誘導蛍光を測定します(例:492 nmおよびem:538 nm).
   手記： pHrodo染色剤は、ファゴソーム内部などの酸性環境でのみ蛍光を発します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	メルク		YMプレートの準備に使用
酵母エキス	メルク		YMプレートの準備に使用
麦芽エキス	メルク		YMプレートの準備に使用
ペプトン	メルク		YMプレートの準備に使用
酵母窒素ベース(YNB)	ディフコラボラトリーズ		クリプトコッカス細胞の培養に使用
グルコース	メルク		YMプレートの準備に使用
トリパンブルーステイン	シグマ・アルドリッチ		生細胞と死細胞を列挙するには
リン酸緩衝液(PBS)	シグマ・アルドリッチ		細胞の洗浄と希釈
RPMI-1640ミディアム	バイオクロム		マクロファージの培養培地
ウシ胎児血清(FBS)	バイオクロム		RPMI-1640培地を補完するために使用
ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ		RPMI-1640 ミディアムに追加
pHrodoグリーンザイモサンA染色	ライフテクノロジー		pHの変化による内在化細胞の染色に使用
アセチルサリチル酸(アスピリン)	シグマ・アルドリッチ		試験する薬剤
無水エタノール	メルク		アスピリンを溶かすために使用
イブプロフェン	シグマ・アルドリッチ		検査する薬物
ジメチルスルホキシド(DMSO)	メルク		イブプロフェンの溶解に使用
96ウェル平底マイクロタイタープレート	グライナーバイオワン		反応を運び出す容器として使用される
ティッシュフラスコ	ラセック		マクロファージの培養に使用
15 mL遠心チューブ	ラセック		マクロファージの封じ込めに使用
セルクラッパー	ラセック		組織フラスコからマクロファージを分離するために使用
接種ループ	ラセック		寒天プレートに培養物をストリークするために使用されます
血球計算盤	マリエンフィールド		マクロファージの細胞濃度を決定するため
1.5 mLプラスチックチューブ	メルク		反応を運び出す容器として使用される
EZ Read 800 研究用分光光度計	バイオクロム		光学濃度を読み取るには
フルオロスカンアセントフロリダ州	サーモサイエンティフィック		蛍光を測定するには
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー		マクロファージのインキュベーションに使用
クラス II安全キャビネット	ESCOの		ユーザーに害を及ぼすことなく、病原体を安全に取り扱うこと。