ヒトサイトメガロウイルスの中和を測定するための免疫蛍光法

要約

このビデオは、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の中和を測定するために設計された免疫蛍光アッセイを示しています。ウイルス特異的抗体をウイルスと混合し、ヒト線維芽細胞とインキュベートします。抗体はウイルスを中和して宿主細胞に感染できなくしますが、中和されていないウイルスは細胞に感染します。インキュベーション後、中和の程度は、免疫蛍光法を用いてウイルス感染細胞を定量することによって決定されます。

プロトコル

1. 感染対象細胞の調製

1. 実験を行う前日に、96ウェルプレート(「ターゲット」プレート)で標的細胞を播種します。
2. ウェルごとに十分なセルをプレート化して、ほぼコンフルエント(~90%)の単層を確保します。
   手記：これは、ターゲット細胞タイプの相対的なサイズによって異なります。ヒト包皮線維芽細胞(HFF)を使用する場合は、20,000細胞/ウェルを播種します。
3. 通常、サンプルごとに 21 個のウェル (7 個 x 3 個) を播種し、プレートごとに 4 個のサンプルを分析できるようにします。
4. プレートごとに追加の12ウェル(つまり、8列目)を播種して、コントロールとして機能します。

2. ウイルスの調製:抗体混合物

1. 90 μLの培地と抗体を混合し(十分に混合)、希望する初期試験抗体濃度の2倍を、新鮮な96ウェルプレート(「希釈」プレート)の1列目の3ウェルに作製します。
   手記：抗体の一般的な開始濃度は20 μg/mLですが、経験的に決定する必要があります。
2. ステップ2.1の3つのウェルの下にある18個のウェル(つまり、6個×3個)のそれぞれに6....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウスモノクローナル抗IE抗体クローン6F8.2	ミリポア	MAB8131	免疫蛍光のための一次抗体
ウサギ抗マウスIgG、Alexa fluor 568標識抗体	インビトゲン	A-11061	免疫蛍光のための二次抗体
WiScan® Hermes ハイコンテントイメージングシステム	アイデアバイオメディカル	-	定量用のハイスループット自動蛍光顕微鏡
Metamorph Image Analysisソフトウェア	分子デバイス	-	画像解析ソフトウェア
ヒトIgG1アイソタイプコントロール	メルク	M5284	中和のためのコントロール抗体
8F9、抗HCMV糖タンパク質B抗体	-	-	HCMVに対する中和抗体
ダピ	サーモサイエンティフィック	62248	細胞核の染色
DMI4000B 倒立蛍光顕微鏡	ライカ	-	代表的な画像に用いる蛍光顕微鏡