ヒトサイトメガロウイルスの中和を測定するための免疫蛍光法

要約

このビデオは、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の中和を測定するために設計された免疫蛍光アッセイを示しています。ウイルス特異的抗体をウイルスと混合し、ヒト線維芽細胞とインキュベートします。抗体はウイルスを中和して宿主細胞に感染できなくしますが、中和されていないウイルスは細胞に感染します。インキュベーション後、中和の程度は、免疫蛍光法を用いてウイルス感染細胞を定量することによって決定されます。

プロトコル

1. 感染対象細胞の調製

1. 実験を行う前日に、96ウェルプレート(「ターゲット」プレート)で標的細胞を播種します。
2. ウェルごとに十分なセルをプレート化して、ほぼコンフルエント(~90%)の単層を確保します。
   手記：これは、ターゲット細胞タイプの相対的なサイズによって異なります。ヒト包皮線維芽細胞(HFF)を使用する場合は、20,000細胞/ウェルを播種します。
3. 通常、サンプルごとに 21 個のウェル (7 個 x 3 個) を播種し、プレートごとに 4 個のサンプルを分析できるようにします。
4. プレートごとに追加の12ウェル(つまり、8列目)を播種して、コントロールとして機能します。

2. ウイルスの調製:抗体混合物

1. 90 μLの培地と抗体を混合し(十分に混合)、希望する初期試験抗体濃度の2倍を、新鮮な96ウェルプレート(「希釈」プレート)の1列目の3ウェルに作製します。
   手記：抗体の一般的な開始濃度は20 μg/mLですが、経験的に決定する必要があります。
2. ステップ2.1の3つのウェルの下にある18個のウェル(つまり、6個×3個)のそれぞれに60μLの培地を加えます。
3. 60 μLの培地を12個のウェル(行8)に加えます。
4. 希釈した抗体30 μLを1列目から2列目の対応するウェルに移します。
5. マルチチャンネルピペットで20回上下にスムーズにピペッティングして、2列目の内容
物を混合します。
6. 希釈した抗体30 μLを2列目から3列目に移します。
7. このミキシングとトランスファーのプロセスを、行 7 の内容がミキシングされるまで繰り返します。
8. 列7を混合したら、列7のウェルから30 μLを廃棄します。
9. HCMVを完全な培地で希釈し、50 μLに十分な感染性粒子が含まれ、細胞に直接添加した場合にMOI=1感染が生じるようにします。
   手記：HCMVはバイオセーフティーレベル2(BSL-2)カテゴリーの病原体です。適切な安全手順が実施されていることを確認し、HCMVにさらされたすべての媒体にフィルターチップを使用してください.
   手記：これには、細胞/ウェルと同じ数の感染性粒子が必要であり、細胞の種類とウイルスの親和性によって異なります。上記のようにHFFを使用する場合、必要なウイルス濃度は4x10⁵ pfu/mL.
   です。 手記：希釈したウイルスが十分に過剰に調製されていることを確認してください(例:10%追加)。
10. 希釈したウイルスストック60 μLを、抗体希釈液を含むすべてのウェルと、60 μL培地のみを含む6ウェルに加えます。
11. 残りの6ウェルの培地のみに60μLの培地のみを加え、感染していないコントロールとして使用します。
12. 得られたウイルスをインキュベートします:抗体混合物を37^°Cで1時間。

3. 標的細胞の感染

1. ターゲット細胞からすべての培地を取り除きます。
2. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLのウイルス:抗体混合物を「希釈」プレートから「ターゲット」プレート上の同等の位置にある細胞に移します。
3. 細胞を37°C、5%CO₂で24時間インキュベートします。

4. 細胞の固定

1. セルからすべての培地を削除します。
   手記：この時点で、ウェル間でチップを交換する必要はありません。
2. すべてのウェルを200 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、取り除きます。
3. 180 μL -20 ^oC、100%エタノールをすべてのウェルに加えます。
4. プレートを-20^°Cで少なくとも30分間インキュベートします.
   手記：このステップは、蒸発し始めるときに追加のエタノールを追加すれば、少なくとも1か月に延長できます.
   手記：この時点からBSL-1条件下でもプレートの取り扱いが安全であり、ノンフィルターチップを使用することができます。

>5. 免疫蛍光法(IF)によるウイルス感染細胞の検出

1. プレートからエタノールを取り除きます。
2. すべてのウェルを200μLのPBSで洗浄し、取り除きます。
3. 200 μL PBSをすべてのウェルに添加し、5分間インキュベートします。
   1. その間、PBSで一次抗体希釈液を調製します。
   2. 1ウェルあたり100 μLの1:2000マウスモノクローナル抗IEが必要です(希釈は材料に記載されている特定の抗体に対するものであることに注意してください).
      注:IFに使用する抗体の希釈は、代替法を使用する場合に最適化が必要になる場合があります。
   3. 十分な混合を確保するためのボルテックス混合物。
4. すべてのウェルからPBSを取り出し、希釈した一次抗体を100 μL加えます。
5. 室温で1時間インキュベートします。
6. すべてのウェルから一次抗体を取り出します。
7. 200 μL PBSを加え、5分間インキュベートします。
   1. その間、二次抗体を調製し、PBSで4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)希釈液を調製します。
   2. 1ウェルあたり100 μLの1:2000蛍光色素標識抗マウスIgGおよび1 μg/mL DAPIが必要です。
   3. 注:IFに使用する二次抗体の希釈は、代替抗体を使用する場合、最適化が必要になる場合があります。
   4. 十分な混合を確保するためのボルテックス混合物。
8. すべてのウェルからPBSを取り出し、100 μLの二次抗体/DAPI希釈液を加えます。
9. プレートを室温で1時間インキュベートし、光から保護します。
10. すべてのウェルから二次抗体/DAPIを除去します。
11. すべてのウェルを200μLのPBSで洗浄し、取り除きます。
12. 200 μL PBSをすべてのウェルに添加し、5分間インキュベートします。
13. PBSを取り外し、100 μL PBSをすべてのウェルに加え、光から保護して、イメージングの準備が整うまで4^°Cで保存します
    手記：プレートは、信号/画質の損失を最小限に抑えて、最大1か月間保存できます。

6. 感染細胞のイメージングとカウント

1. 感染を簡単かつ正確に定量するには、青色(DAPI、核)チャネルと二次抗体(HCMV immediate-early proteins(IE))チャネルの両方で、各ウェルの少なくとも25%をイメージングします
   手記：IE免疫蛍光法によって生成されるシグナルは、核染色のシグナルに類似している必要があり、これを確認するために画像を確認する必要があります。
2. これは手動で行うこともできますが、自動顕微鏡の使用をお勧めします.
   手記：倍率は装置によって異なりますが、大きな構造(原子核)をイメージングするため、通常は4倍/10倍の対物レンズで十分です。
3. 画像を取得したら、選択したソフトウェア解析プログラムで処理します。
   1. まず、青色のチャンネルを介して核を同定し、存在する細胞の数を計算します。
   2. IEは核に局在するタンパク質であるため、感染細胞の数を計算するには、これらの領域のみに赤チャネルのシグナルを確認する必要があります。
4. 感染した細胞の数と細胞の総数を計算したら、ウェルごとに感染の割合を計算します。
5. これらの値は、他のすべてのウェルから感染していないウェルで観察された感染の平均パーセンテージを差し引くことにより、検出のバックグラウンド レベルに対して補正できます。
   手記：これは1%をはるかに下回るはずです。1%を超える場合、分析手順の最適化が必要です。
6. これらの背景補正された値は、必要に応じてプロット、調査、および解析できるようになりました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウスモノクローナル抗IE抗体クローン6F8.2	ミリポア	MAB8131	免疫蛍光のための一次抗体
ウサギ抗マウスIgG、Alexa fluor 568標識抗体	インビトゲン	A-11061	免疫蛍光のための二次抗体
WiScan® Hermes ハイコンテントイメージングシステム	アイデアバイオメディカル	-	定量用のハイスループット自動蛍光顕微鏡
Metamorph Image Analysisソフトウェア	分子デバイス	-	画像解析ソフトウェア
ヒトIgG1アイソタイプコントロール	メルク	M5284	中和のためのコントロール抗体
8F9、抗HCMV糖タンパク質B抗体	-	-	HCMVに対する中和抗体
ダピ	サーモサイエンティフィック	62248	細胞核の染色
DMI4000B 倒立蛍光顕微鏡	ライカ	-	代表的な画像に用いる蛍光顕微鏡