色素標識磁性ミクロスフェアを用いたマルチプレックス定量的細菌検出

要約

このビデオは、異なるセットに染色されたカルボキシル化磁性ポリスチレン微小球を使用した多重化された定量的細菌検出を示しています。この手順には、ビーズ-バクテリア複合体の形成、磁気分離、およびフローベースの分析が含まれ、同じ反応ウェル内の複数のバクテリアの正確かつ同時定量が可能になります。

プロトコル

1. 捕捉抗体とMagPlexマイクロスフェアの共有結合

各捕捉抗体は、以下に説明する2段階の手順を使用して、特定のカルボキシル化磁気マイクロスフェアセットに結合されます。

>注:マイクロスフィアカップリングに必要なすべての試薬、バッファー、および材料を含むカップリングキットも利用可能です(材料の表を参照)。

1. マイクロスフィアに付属の製品情報シートに記載されている指示に従って、ストックの非結合マイクロスフェアサスペンションを再懸濁します。
   手記：再懸濁の手順は、ストックマイクロスフィアバイアルのサイズと容量によって異なります。
2. ストックマイクロスフィアの2.5 x 10⁶を推奨マイクロ遠心チューブに移します(材料の表を参照)。
3. チューブを磁気セパレーターに入れ、60秒間分離します。
4. チューブを磁気セパレーターに配置したまま、上清を取り除きます。
   手記：ミクロスフェアを乱さないように注意してください。
5. チューブを磁気セパレーターから取り外し、渦巻きと超音波処理により20秒間、ミクロスフェアを100μLのdH₂Oに再懸濁します。
6. 手順 3 と 4 を繰り返します。
7. チューブを磁気セパレーターから取り外し、洗浄したミクロスフェア80μLの0.1Mリン酸ナトリウム一塩基性、pH 6.2を再懸濁し、ボルテックスおよび超音波処理により20秒間。
8. 50 mg/mL N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ-NHS)(0.1 Mリン酸ナトリウム一塩基性、pH 6.2で希釈)10 μLをミクロスフェアに加え、ボルテックスで穏やかに混合します。
9. 50 mg/mL 1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)(0.1 Mリン酸ナトリウム一塩基性、pH 6.2で希釈)10 μLをミクロスフェアに加え、ボルテックスで穏やかに混合します。
10. 室温で20分間インキュベートし、10分間隔でボルテックスによる穏やかに混合します。
11. チューブを磁気セパレーターに入れ、60秒間分離します。
12. チューブを磁気セパレーターに配置したまま、上清を取り除きます。
    手記：ミクロスフェアを乱さないように注意してください。
13. チューブをマグネティックセパレーターから取り外し、ミクロスフェアを250μLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4に再懸濁し、ボルテックスおよび超音波処理により約20秒間静置します。
14. チューブを磁気セパレーターに入れ、60秒間分離します。
15. チューブを磁気セパレーターに配置したまま、上清を取り除きます。
    手記：ミクロスフェアを乱さないように注意してください。
16. 手順13〜15を繰り返して、合計2回の洗浄を行います。
17. 磁気セパレーターからチューブを取り外し、活性化および洗浄したマイクロスフェアを100μLのPBS、pH 7.4にボルテックスおよび超音波処理により約20秒間再懸濁します。
18. 12.5 μgの捕捉抗体を再懸濁したマイクロスフェア(すなわち、5 μg/100万マイクロスフェア)を添加します。
    手記：モノクローナル抗体は捕捉に好まれますが、ポリクローナル抗体も使用できます.
    注:100万ビーズあたり5 μgのタンパク質は通常、良好な性能を発揮しますが、最適なアッセイ性能を得るためには、その量を滴定することをお勧めします。
19. PBS、pH 7.4で総容量を500 μLにします。
20. 渦による混合カップリング反応。
21. 暗所で室温で回転させて混合し、2時間インキュベートします。
22. チューブを磁気セパレーターに入れ、60秒間分離します。
23. チューブを磁気セパレーターに配置したまま、上清を取り除きます.
    手記：ミクロスフェアを乱さないように注意してください。
24. マグネティックセパレーターからチューブを取り外し、結合したマイクロスフェアを1mlのPBS、0.02%Tween-20、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.05%アジ化ナトリウム(PBS-TBN)を含むpH 7.4に再懸濁しますボルテックスおよび超音波処理により20秒間。
25. チューブを磁気セパレーターに入れ、60秒間分離します。
26. チューブを磁気セパレーターに配置したまま、上清を取り除きます。
    手記：ミクロスフェアを乱さないように注意してください。
27. 手順24〜26を繰り返して、合計2回の洗浄を行います。
28. マグネティックセパレーターからチューブを取り外し、結合したマイクロスフェアを500μLのPBS-TBN.
    に再懸濁します 手記：セルカウンターまたは血球計算盤を使用して回収したマイクロスフェアの数を決定します。
29. 結合マイクロスフェアは、暗闇で2〜8°Cで冷蔵保存してください.
    手記：結合効率を確認するためのプロトコルも利用可能です。

2. 検出抗体のビオチン標識

1. 検出抗体は、製造元の指示に従ってEZ-Linkスルホスクシンイミジル-6-(ビオチンアミド)ヘキサン酸を使用してビオチン標識し、20倍モル過剰のビオチン試薬を使用して、抗体分子あたり4〜6個のビオチン基を達成しました
   手記：検出には通常、ポリクローナル抗体が使用されますが、捕捉抗体とは異なるエピトープに特異的な場合は、モノクローナル抗体も使用できます
   手記：あるいは、市販のビオチン化抗体を検出に用いてもよい。

>3. Multiplexed Capture Sandwich Immunoassayによる生物の検出

上記1および2で生成された結合マイクロスフィアセットと標識検出抗体は、マルチプレックスキャプチャサンドイッチ免疫測定法で使用され、サンプル中に存在する細菌を検出および定量します。アッセイワークフローの概要を図1に示します。

1. 抗体結合MagPlexビーズセットのストックバイアルを2〜8°Cのストレージから選択します。
2. ボルテックスし、20秒間超音波処理します。
3. PBS-TBN.
   中の各反応ウェル(50,000ビーズ/セット/ml)について、各ビーズセットが50μLあたり2500マイクロスフェアの最終濃度になるように、作業用マルチプレックスビーズミックスを調製します 手記：スプレッドシートを使用して、作業ビーズミックスの準備パラメータを決定します.
   手記：アッセイおよび装置の性能をモニターするために、内部コントロールビーズ(RP1モニターマイクロスフェア)も含まれる場合があります。
4. 50 μLの作業用ビーズミックスをピペットで96ウェルプレートの適切なウェルに混合します。
5. 50 μLの標準またはサンプルを適切なウェルにピペットで移します。
6. PBS-TBNを各バックグラウンドウェルに50μLピペットで固定します。
7. プレートをホイルシールで覆ってビーズを光から保護し、プレートシェーカーで室温で1時間インキュベートし、800rpmで振とうします。
8. プレートを磁気プレートセパレーターに1分間置きます。
9. プレートを磁気プレートセパレーターに保持し、ホイルを慎重に取り外し、プレートを反転させてウェルを空にしてから、実験用ペーパータオルの厚い層で3〜4回軽くたたいて乾かします
   手記：あるいは、マルチチャンネルピペッターを使用してウェルを手動で吸引するか、自動プレートウォッシャーを使用します。
10. マルチチャンネルピペッターを使用して各ウェルに200μLのPBS-TBNを加え、プレートシェーカーで800rpmで1分間振とうします。
11. プレートを磁気プレートセパレーターに1分間置きます。
12. 磁気プレートセパレーターにプレートを保持したまま、プレートを反転させてウェルを空にし、次に実験用ペーパータオルの厚い層で3〜4回タップして乾かします><。 手記：あるいは、マルチチャンネルピペッターを使用してウェルを手動で吸引するか、自動プレートウォッシャーを使用します。
13. 手順10〜12を繰り返して、合計2回の洗浄を行います.
    手記：次のステップに進む前に、反応の潜在的な希釈を避けるために、できるだけ多くのバッファーを除去してください。
14. マルチチャンネルピペッターを使用して、各ウェルに50 μLのアッセイバッファーを加え、プレートシェーカーで800 rpmで1分間振とうします。
15. ビオチン化検出抗体をPBS-TBNで4 μg/mLに希釈します。
16. 希釈した検出抗体50 μLを各ウェルに加えます。
17. プレートをホイルシールで覆ってビーズを光から保護し、プレートシェーカーで室温で1時間インキュベートし、800rpmで振とうします。
18. プレートを磁気プレートセパレーターに1分間置きます。
19. 磁気プレートセパレーターにプレートを保持したまま、プレートを反転させてウェルを空にし、次に実験用ペーパータオルの厚い層で3〜4回タップして乾かします><。 手記：あるいは、マルチチャンネルピペッターを使用してウェルを手動で吸引するか、自動プレートウォッシャーを使用します。
20. ステップ10-12で説明されている手順に従って、各ウェルを2回洗浄します。
    手記：次のステップに進む前に、反応の潜在的な希釈を避けるために、できるだけ多くのバッファーを除去してください。
21. マルチチャンネルピペッターを使用して、各ウェルに50 μLのアッセイバッファーを加え、プレートシェーカーで800 rpmで1分間振とうします。ストレプトアビジン、R-フィコエリトリンコンジュゲート(SAPE)。
22. SAPEレポーターをアッセイバッファー中で4 μg/mLに希釈します。
23. 希釈したSAPEを50 μLを各ウェルに加えます。
24. プレートをホイルシールで覆い、ビーズとSAPEを光から保護し、プレートシェーカーで室温で30分間インキュベートし、800rpmで振とうします。
25. プレートを磁気プレートセパレーターに1分間置きます。
26. 磁気プレートセパレーターにプレートを保持したまま、プレートを反転させてウェルを空にし、次に実験用ペーパータオルの厚い層で3〜4回タップして乾かします><。 注:または、マルチチャンネルピペッターを使用してウェルを手動で吸引するか、自動プレートウォッシャーを使用します。
27. 手順10〜12で説明されている手順に従って、各ウェルを2回洗浄します。
28. 各ウェルに100 μLのPBS-TBNを加え、プレートシェーカーで800 rpmで1分間振とうします。
29. Luminexアナライザーで各反応の50μLを分析し(使用するアナライザーのユーザーマニュアルに従って)、分析のためにビーズセットごとに最低50個のビーズを収集します。xMAP INTELLIFLEX®の簡単な説明を以下に示します。
    1. 画面の左上隅にあるドロップダウンメニューを選択し、[プレート構成]に移動します。
    2. [Run Plate] を選択します。
    3. イジェクトアイコンを選択して、プレートキャリアをイジェクトします。
    4. プレートをプレートキャリアにロードし、リトラクト アイコンを選択してプレートキャリアをリトラクトします。
    5. [実行] アイコンを選択して、プレートを実行します。

結果

図1:マルチプレックスキャプチャサンドイッチイムノアッセイワークフロー。抗体結合マイクロスフェアのマルチプレックス混合物を各ウェルに分注し、サンプルを添加します。1時間のインキュベーション後、反応液を洗浄し、ビオチン化検出抗体を添加します。1時間のインキュベーション後、反応物を再度洗浄し、SAPEレポーターを添加します。反応を30分間インキュベートし、洗浄し、結果をxMAPフローアナライザーで読み取ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MagPlex®マイクロスフィア	ルミネックス®	MC100xx-YYの	各カタログ番号については、ウェブサイトをご覧ください(https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order)
1.5 mL微量遠心チューブ	エッペンドルフ™	22431081	プロテインLoBind®
0.1 M 一塩基性リン酸ナトリウム (NaH2PO4)、pH 6.2	ミリポアシグマ	S3139	アクティブ化バッファー
1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)	サーモサイエンティフィック™	ピアス™ 77149
N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(スルホ-NHS)	サーモサイエンティフィック ™	ピアス™ 24510
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4	ミリポアシグマ	P3813	カップリングバッファ
xMAP®抗体カップリングキット	ルミネックス®	〒40-50016	マイクロスフェアカップリング用のオプションキットが利用可能です。
抗大腸菌 O157:H7 抗体	セラケア	〒5310-0326	ポリクローナル、捕捉と検出の両方に使用されます
抗サルモネラCSA-Plus抗体	セラケア	〒5310-0321	ポリクローナル、捕捉と検出の両方に使用されます
抗カンピロバクター属抗体	セラケア	〒5310-0324	ポリクローナル、捕捉と検出の両方に使用されます
抗リステリア抗体	セラケア	〒5310-0319	ポリクローナル、属特異的、捕捉と検出の両方に使用
PBS、pH 7.4、0.02% Tween-20、0.1% BSA、0.05% アジ化ナトリウム (PBS-TBN)	ミリポアシグマ	P3563 A7888 S8032	最大1%のBSAを使用できます
抗大腸菌 O157:H7 抗体	セラケア	〒5310-0326	ポリクローナル
(EZ-Link スルホ-NHS-LC-ビオチン) (ピアス)。	サーモサイエンティフィック™	A39257の
大腸菌O157:H7	セラケア	〒5370-0013	ヒートキル
サルモネラ菌 血清型:チフス菌	セラケア	〒5370-0002	ヒートキル
カンピロバクター・ジェジュニ	セラケア	〒5370-0011	ヒートキル
リステリア菌	セラケア	〒5370-0010	ヒートキル
ストレプトアビジン、R-フィコエリトリンコンジュゲート(SAPE)	サーモサイエンティフィック™	S866