好中球タンパク質の単離と消化

要約

このビデオでは、好中球からのタンパク質の単離がさらに処理され、より小さなペプチドに消化される様子を実演しています。これらのペプチドは、将来の分析に使用できます。

プロトコル

1. 好中球細胞の収集と溶解

1. 好中球分化HL60細胞を15 mLチューブに集め、サンプルを400 x gで5分間遠心分離します
   手記：好中球は、分化後、3.5 x 10⁵細胞/mLのコンフルエントにある必要があります。総プロテオーム抽出のために約500万個の細胞を採取します。
2. 上清を捨て、15 mLのリン酸緩衝液(PBS)をチューブに加えます。
3. サンプルを400 x gで5分間遠心分離します。
4. 手順1.2から1.3を繰り返します。
   手記：細胞サンプルは、実験の時間枠に応じて、液体窒素で急速凍結し、ステップ1.4の後に-80°Cで保存することができます。
5. プロテイナーゼ阻害剤カクテル(PIC)錠剤を含む100 mM Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)pH 8.5の冷たく300 μlを各サンプルに加えます。
6. ボルテックスサンプルを簡単に。
7. 1/10容量の20%SDSを最終濃度の2%SDSに加えます。
8. 細胞サンプルを溶解するには、氷浴でサンプルを30秒間オンおよび30秒間オフにし、10%の電力で5サイクル超音波処理します。
9. 短いスピン(最大速度5〜10秒)でサンプルを遠心分離します。
   手記：細胞の破片をペレットにしないでください。短いスピンを使用して、チューブ壁からスプレーを収集します。
10. 15 mLチューブからサンプルを2 mLチューブに移します。
11. 1/10容量の1 Mストックジチオスレイトール(DTT)を最終濃度10 mM DTTに加えます。
12. ボルテックスサンプルを簡単に。
13. サンプルを800rpm、95°Cで振とうしながら10分間インキュベートします。
14. 10分後、サンプルを室温まで冷却します.
    手記：サンプルを氷の中に置くことで、冷却プロセスをスピードアップすることができます。
15. 1/10容量の0.55 mMヨードアセトアミド(IAA)を最終濃度55 mM IAA.
    に加えます。 手記：IAAが光にさらされないように、暗闇で手順1.15を実行します。
16. ボルテックスサンプルを簡単に。
17. サンプルを室温で20分間、暗所でインキュベートします。
18. 氷冷アセトンを最終濃度80%で100%添加し、サンプルを-20°Cで一晩保存します。
    手記：-20°Cでの保存は、必要に応じて最大2週間行うことができます。

2. 好中球タンパク質の消化

1. サンプルを13,500rpm、4°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを沈殿させます。
2. 上清を捨て、細胞ペレットを500 μlの80%氷冷アセトンで洗浄します。
3. 13,500 rpm、4°Cで10分間サンプルを遠心分離し、上清を除去します。
4. 手順2.1から2.3を繰り返します。
5. 風乾ペレット。
6. 乾燥したら、100 μlの8 M Urea/40 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)を細胞ペレットに加え、4°Cの水浴で30秒間、15サイクル連続で超音波処理して、タンパク質ペレットを再溶解します。
7. ウシ血清アルブミン(BSA)トリプトファンアッセイ(または同等物)を使用すると、製造元の指示に従ってタンパク質濃度を定量化できます。
8. 300 μlの重炭酸アンモニウム (ABC) を加えて、サンプルを最終濃度の2 M尿素に希釈します。
9. 50 μgのタンパク質を消化するには、氷上のサンプルに1:50のトリプシン/LysC(酵素とタンパク質の比率)を加え、軽くたたいてサンプルを混合します。
10. サンプルを室温で一晩インキュベートし、分解を行います。

結果

図 1.質量分析に基づくプロテオミクスプロファイリングのための好中球に分化したHL60細胞のワークフロー。未分化および分化(DMSO化学刺激による)HL60細胞株を培養、収集、および処理して、全プロテオーム抽出を行いました。タンパク質をTrypsin/LysCで消化し、C18 STAGE-tipsを使用してペプチドを精製した後、LC-MS/MS.で検出しました。Biorender.com で生成された図

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15mlファルコンチューブ	VWRの	470225から000
25 mLの血清学的	フィッシャーサイエンティフィック	14955235
重炭酸アンモニウム(ABC)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A643-500
アセトン	シグマ・アルドリッチ	34850から1L
BSAアッセイキット	VWRの	CA62408-940
遠心分離機 5810 R	シグマ・アルドリッチ	EP022628188
ジチオスレイトール(DTT)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R0861	DTTアリコートの1Mストックを準備し、-20°Cで保存
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12483020	解凍し、アリコートを準備し、-20°Cで保存
ヒーティングブロック
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J	8M尿素/ 40MHEPESアリコートを準備し、-20°Cで保存
ヨードアセトアミド(IAA)	フィッシャーサイエンティフィック	AAA1471514	0.55MのIAAアリコートのストックを準備し、-20°Cで保存します。光に触れないようにしてください
L-グルタミン	フィッシャーサイエンティフィック	25030081	解凍し、アリコートを準備し、-20°Cで保存
液体窒素
LoBind微量遠心チューブ	エッペンドルフ	13-698-794
ペニシリンストレプトマイシン、アムホテリシン	シグマ・アルドリッチ	A5955	解凍し、アリコートを準備し、-20°Cで保存
好中球分化HL60細胞
リン酸緩衝液(PBS)	バイオショップ	PBS408	室温で保存
プローブソニケーター	フィッシャーサイエンティフィック	〒100-132-894
プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)錠	シグマ・アルドリッチ	5892791001	4°Cで保存
RPMIの1640	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11875093	4°Cで保存
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	J18220です。A1	2% SDS溶液を調製
SpeedVac遠心分離機	エッペンドルフ	07-748-15
T75フラスコ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	156499
トリスHCL pH 8.5	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-1	4°Cで保存
超音波浴	VWRの	97043-960
尿素	バイオショップ	URE001.1

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