ペプチドの脱塩と精製のためのSTAGEチップ手順

1. ペプチドの精製と脱塩

1. 各ペプチドサンプルについて、200 μLのピペットチップに3層のC18レジンを詰めて、STop And Go Extraction (STAGE)チップを作製します。
2. 1/10 停止溶液(20% アセトニトリル [ACN] および 6% トリフルオロ酢酸 [TFA]) をサンプルに添加します。
3. ペレット沈殿のためのサンプルを遠心分離機にかけ、13,200 rpmで10分間沈殿させます。
4. 上清を新しい2mLチューブに移し、ペレットを廃棄します。
5. ステージチップを100 μlの100% ACNで洗浄します。
6. STAGEチップを1000 x gで2分間遠心分離
   手記： すべての液体がC18樹脂を通過するまで、STAGEチップを遠心分離します。
7. STAGEチップを50 μLのバッファーB(80%ACN、0.5%酢酸、およびddH₂O)で洗浄します。
8. STAGEチップを1000 x gで2分間遠心分離します。
9. STAGEチップを200 μLのバッファーA(2%ACN、0.1%TFA、0.5%酢酸、およびddH₂O)で洗浄します。
10. ステージチップを1000 x gで2分間遠心分離します。
11. サンプルをSTAGEチップにロードします。
12. 1000 x gでサンプルを3〜5分間遠心分離します。
13. STAGEチップを200μlのバッファーAで洗浄します。
14. 1000 x gで3〜5分間遠心分離します。
15. 各STAGEチップに50 μlのバッファーBを添加
します。
16. シリンジを使用して、バッファーBを含むサンプルを0.2 mL PCRストリップチューブに溶出します。
17. サンプルが溶出されたら、真空遠心分離機を使用してペプチドを45分間乾燥させます。
18. サンプルが乾燥したら、MS.
    まで室温で保存してください 手記：ペプチドを2週間以上保存する必要がある場合は、-20°Cで保存することをお勧めします。
19. 高分解能質量分析(MS)でサンプルを実行します.
    手記： サンプル測定パラメータ(ロードしたサンプルの量、液体クロマトグラフィーのグラジエントの長さ、分解能など)は、使用する機器によって異なります。

2. 好中球のプロテオミクスプロファイリング

1. 生データ処理
   1. MSから取得したRawデータファイルをMaxQuantにアップロードします。
   2. このソフトウェアは、ボトムアップのデータ依存型集録ファイルで動作するように設計されており、多くのデフォルトパラメータはそのようなサンプル用に最適化されています。デフォルトのパラメータには、消化(トリプシンP)、タンパク質のメチオニン酸化(酸化(M))およびN-アセチル化(アセチル(タンパク質Nターム))の可変修飾、およびシステイン(カルバミドメチル(C))のカルバミドメチル化の固定修飾が含まれます。
   3. これらのパラメーターの調整には、ラベルフリー定量(LFQ;最小比率カウントを1に設定)、Match Between Runs(つまり、オン/オフ)、およびタンパク質ごとに同定されるペプチドの最小数(2に設定を推奨)が含まれます。
   4. グローバルパラメータで、シーケンス識別用のFASTAファイルをインポートします。この実験では、UniprotデータベースのHomo sapiens (Human) (UP000005640) FASTAファイルを使用しました。手記：記録保持のために次の情報を記録します: Organism ID = 9606;タンパク質の数= 79,740;ファイルのダウンロード日。
   5. 処理に使用するコンピューター コアの数を設定し、[開始] を選択します。
   6. MaxQuantが完了すると、「結合」フォルダが他のファイルとともに生成されます。
      手記：他のファイルは、ペプチド、修飾などを同定するために使用され、Proteome Xchange(PRIDE)を含むデータリポジトリに完全なデータセットをアップロードするために必要になる場合があります。
2. ペルセウスでのデータ分析と視覚化
   1. 「proteingroups.txt」をペルセウスにアップロードし、「メイン」ウィンドウのすべてのLFQ強度ファイルを選択します。
      手記：ベースライン情報は Perseus ウィンドウに直接インポートされますが、他の情報 (変更サイトなど) を手動で追加する必要がある場合があります。
   2. 汚染物質、リバースペプチド、および部位によってのみ同定されたペプチドを除去して、行をフィルタリングします。
   3. log₂(x) でデータを変換します。
   4. 各反復で検出されるタンパク質の数を観察するには、数値ベン図を作成します。
   5. 各サンプルのカテゴリ注釈を設定します.
      手記： 統計上の理由から、1つの生物学的サンプルのすべての反復は同じ名前を持つ必要があります。
   6. 有効な値に基づいて行をフィルタリングし、反復の >50% で同定されたタンパク質と少なくとも 1 つのグループ内で同定します。
      手記： 有効な値によるフィルタリングは、実験のセットアップと目標に応じて、より厳密になる場合があります(たとえば、すべてのサンプルにタンパク質が存在する必要があります)。
   7. LFQの欠損値を置換するために、正規分布からの代入を行うことができます.
      注:デフォルトのパラメータはLFQデータ用に最適化されていますが、必要に応じて調整できます。
   8. タンパク質の行にアノテーション情報を追加します。txt.gz FASTA ファイル (Perseus の Web サイトから取得) を 'bin'、'conf'、および 'annotation' フォルダーに追加し、特定の用語 (タンパク質名、遺伝子名、遺伝子オントロジーなど) を取り込みます。
   9. これでマトリックスが完成し、統計的検定(ANOVA、t検定など)に使用して、試験条件間のタンパク質存在量の有意な変化を判断できます。視覚化ツールの他の形式には、主成分分析プロット、ヒートマップ、およびカテゴリエンリッチメントが含まれます.
      手記：アノテーション情報はUniProtからダウンロードして、Perseusフレームワークに統合することもできます。