機能性SARS-CoV-2中和抗体の評価

要約

このビデオでは、SARS-CoV-2ウイルスの中和における血清の有効性を測定する中和アッセイを紹介しています。これには、偽型ウイルス、血清希釈、および発光ベースの定量が含まれ、中和力価が明らかになります。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 擬似型ベースの中和アッセイ

>注:pMNは、SARS-CoV-2スパイクに対する抗体を含むヒト回復期血清サンプルを介した偽型ウイルス(PV)媒介形質導入の阻害です。

1. 96ウェルのホワイトプレートに、マルチチャンネルピペットを使用して、50 μlのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、10%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)を行BからH、列1〜12に追加します。
2. 行 A の列 2 から 10 のウェルに 5 μl の回復期血清を合計 100 μl DMEM/10% FBS/1% P/S で加えます。既知の量 (例: 5 μl) の陽性 (NIBSC 20/162 キャリブラント、HICC プール 2 または HICC プール 3) および陰性抗血清 (2019 年より前に採取された患者血清) をウェル A11 および A12 にコントロールとして追加します。
3. 列Aのウェルから50μlを取り出し、その下のすべてのウェルで2倍段階希釈を行います。
4. 希釈ステップごとに、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡が発生しないように注意しながら、ピペッティングを上下させて5〜10回混合します。
5. 段階希釈が完了したら、各カラムの最終ウェルから最後の50 μlを廃棄する必要があります
   注:この時点で、各ウェルには50 μlの混合DMEMと、患者血清または対照血清の段階希釈液が含まれている必要があります。
6. プレートを500rpmで1分間遠心分離し、ウェルの壁に液体が残らないようにします。
7. 疑似型滴定で得られたデータを使用して、SARS-CoV-2 PVを希釈して50 μl中5 x 10⁶ RLU、総容量5 mLを得るために必要なDMEMの量を計算します。
8. この希釈したPV溶液をマルチチャンネルピペットを使用してピペット洗面器で混合し、ウェルA6-A12(細胞のみのコントロール)を除くプレート上の各ウェルに50μlを分注します。A1-A6 は PV のみの制御として機能します。
9. 500rpmで1分間プレートを遠心分離し、ウェルの壁にウイルスが残っていないことを確認します。
10. プレートを37°Cの5%二酸化炭素(CO₂)で1時間インキュベートし、血清がSARS-CoV-2糖タンパク質に結合するのを待ちます。
11. 24時間前にアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)発現プラスミドおよび膜貫通型セリンプロテアーゼ2(TMPRSS2)発現プラスミドをトランスフェクトしたHEK 293T/17標的細胞のプレートを調製します。
    1. 培地をプレートから取り出します。
    2. 皿の片面に2mlのPBSを入れてプレートを2回洗って、細胞の剥離や廃棄を防ぎます。
    3. プレートに2mlのトリプシンを加え、細胞が剥がれるまでプレートをインキュベーターに入れます。
    4. 細胞が剥離した後、プレートに6 mlのDMEM/10%FBS/1%ペニシリン/ストレプトマイシンを加えてトリプシン活性をクエンチし、細胞を穏やかに再懸濁します。
    5. TC20^TM Automated Cell Counterまたは計数チャンバースライドを使用して細胞をカウントし、各ウェルに合計50 μlの細胞1 x 10 4細胞を加えます。
12. プレートを37°C、5%CO₂で48〜72時間インキュベートします。
13. GloMax® Navigator LuminometerでBright Glo^TMルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、すべてのウェルから培地を取り出し、PBS:Bright Glo^TMルシフェラーゼアッセイ試薬の1:1ミックスを25 μl加えてプレートを読み取ります。
14. ルミノメーターから提供された生データから、確立されたプロトコルを使用して、半値最大阻害濃度(IC50)中和抗体価を計算します。1:40希釈未満のIC50値はマイナスと見なされます。また、AutoPlateを使用してデータを評価することもできます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MultiGuard バリアピペットチップ 1-20 μl	ソレンソン・バイオサイエンス	30550トン
MultiGuard バリアピペットチップ 1-200 μl	ソレンソン・バイオサイエンス	30550トン
NuncTM 細胞培養ディッシュ デルタ 表面処理済み (10 cm 滅菌ディッシュ)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150350
ピペット洗面器(50ml)	ジェネリック
96ウェルホワイトプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	136101
HEK 293T/17セル	ATCCの	CRL-11268
宿主細胞侵入受容体アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)発現プラスミド:pCDNA3.1+-ACE2			シモンズ 2004
コロナウイルススパイク(S)タンパク質プライミング膜貫通型セリンプロテアーゼ2(TMPRSS2)発現プラスミド:pCAGGS-TMPRSS2			バートラム 2010
4.5 g/L グルコースを配合したダルベッコの修正イーグルミディアム (DMEM) に 10% のウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) を添加	パンバイオテクノロジー	P04-04510 P40-37500 P06-07100
FuGENE® HDトランスフェクション試薬 1ml	プロメガ	E2311
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	パンバイオテクノロジー	P10-040100
SARS-CoV-2 PV (NIBSC, code: 20/162, available international, or HICC-pool 2/HICC pool 3) を中和できるポジティブコントロール抗体 (Research Reagent for Anti-SARS-CoV-2 Ab)
COVID-19ヒト回復期血漿のテスト
Bright Glo ルシフェラーゼアッセイシステム	プロメガ	E2650