マウス尿グルコース濃度の定性的および定量的評価のためのアッセイ

要約

このビデオでは、マウスの尿を採取し、その血糖値を評価する手順を示しています。グルコースレベルを評価するには、酵素と発色性色素でコーティングされたテストストリップをサンプルに浸し、グルコースレベルを示す色の変化を開始します。尿グルコースレベルを定量するには、グルコース濃度が上昇したマルチウェルプレートに尿サンプルを導入し、反応混合物を添加してインキュベートします。吸光度を測定して標準曲線を作成し、サンプル吸光度に基づいてグルコースレベルを計算します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. スポット尿グルコース検査

1. きれいなパラフィルムを平らな面に置きます。
2. ネズミの尻尾をそっとつまみ、パラフィルムにセットします。
3. 親指と人差し指を使用して、マウスの首筋を拘束します。首筋を拘束したままマウスをそっと持ち上げると、ストレス反応としてマウスが排尿します。尿の滴がパラフィルムの表面に落ちるのを待ちます。尿滴を集めた後、マウスをケージに戻します。
4. Diastixストリップの試薬端を、パラフィルム表面に集めた新鮮な尿滴に浸します。すぐにストリップを取り外し、色面を上にして表面に平らに置きます。ストリップに色が完全に現れるまで、少なくとも30秒待ちます。現像した色を、Diastixコンテナに付属の参照チャートと比較します(図1)。
   ヒント：マウスがパラフィルムで排尿しない場合は、人差し指を使用してマウスの下腹部(尿膀胱周辺)に穏やかな圧力をかけます。.このアプローチは、尿滴をパラフィルムに放出するのに役立ちます。上記の手順を踏んでも排尿しないマウスの場合は、20分待ってから再度手順を開始してください。すべての手順がIACUCガイドラインを遵守しながら実行されていることを確認してください。

>2. マウス代謝ケージを用いた24時間尿の採取

1. 製造元の指示に従って、Tecniplast代謝ケージ(図2)を組み立てます。
2. フィードアセンブリに粉末チャウを充填し、フィードアセンブリを上部チャンバーの適切な金属タブに取り付けます。
3. ウォーターボトルのサポートを上部チャンバーの残りの金属タブに固定します。
4. 空のウォーターボトルを満たしてから、ボトルサポートにスライドさせて、シッパーチューブが穴にあることを確認します。
5. メタボリックケージにマウスを入れてから、蓋で覆います。
6. ケージの蓋が適切に取り付けられていることを確認してください。
7. 採尿チューブと採便チューブをチャンバーフロア下部の適切な場所に配置します。.
8. 24時間後、尿収集チューブを取り出し、グルコースアッセイを実行して尿グルコース濃度を決定します。.グルコースアッセイを同日に行わない場合は、尿サンプルを-80°Cの冷凍庫で凍結します。

>3. 24時間の尿グルコース濃度の測定

1. 尿サンプルを-80°Cで保存する場合は、グルコースアッセイを行う前にサンプルを解凍してください。
2. 100mg/dlのストックから、アッセイキットの指示に従って、25mg/dlから0mg/dlまでの8つの標準試料を調製します。
3. キットマニュアルに従って、標準ウェルと尿サンプルウェルを96ウェルプレートにすべて重複して調製します。
4. 推奨量の酵素混合物をすべてのウェルに添加して反応を開始した後、プレートを覆い、37°Cで10分間インキュベートします。
5. プレートリーダーを使用して500-520nmで吸光度を読み取ります。
6. アッセイキットの指示に従ってデータを分析します。各標準物質の吸光度とグルコース濃度をプロットし、グラフを使用して 24 時間尿サンプルのグルコース濃度を決定します。

結果

図 1.スポット尿グルコーステスト。Parafilmに採取したマウスの尿滴と、Diastix容器に載せたカラーリファレンスチャート。

図 2.24時間のマウス尿コレクションのためのTecniplastの新陳代謝ケージ。マウスは、24時間の尿を収集するために、このケージに単独で収容されます。