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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 養子細胞療法による不変ナチュラルキラーT細胞(iNKT細胞)の取得
- iNKT細胞の指向性誘導
- 正常なマウスにα-ガラクトシルセラミド(α-GalCer)(0.1 mg / kg体重)を腹腔内注射します。.
- iNKT細胞の単離
- モデリングの 3 日後、麻酔のために 1% ペントバルビタールナトリウム (50 mg/kg 体重) をマウス腹腔内注射します。適切に麻酔をかけたマウスは、つま先のつまみに対して後足の離脱反応を示しません。
- DBA/1マウスの脾臓をα-GalCerで腹腔内に注射した後、脾臓を分離します。200メッシュのふるいで脾臓を切断し、粉砕することにより、単一細胞懸濁液を調製します。
- 細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、200 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。繰り返す。
- 細胞を1 mLの全血および組織希釈溶液で再懸濁します。3 mLのマウスリンパ球分離培地を添加し、細胞を室温で300 x gで20分間遠心分離します。
- 乳白色リンパ球の層(すなわち、上から2番目の層)を収集し、PBSで2回洗浄し、自動セルカウンターでカウントします。
- iNKT細胞の精製のための磁気活性化細胞選別(MACS)ポジティブセレクション戦略
手記：CD1d四量体の前処理として、1 mg/mLのα-Galcerを0.5%のTween-20および0.9%のNaClで200 μg/mLに希釈し、得られた溶液5 μLをCD1d四量体溶液100 μLに添加しました。混合物を室温で12時間インキュベートし、4°Cで保存して使用しました。T細胞受容体(TCR)βを脱イオン水で80倍に希釈しました。他のすべての抗体をストック溶液として使用しました。
- 107細胞を100 μLの4 °C PBSで再懸濁し、10 μLのα-GalCerをロードしたCD1d Tetramer-phycoerythrin(CD1d Tetramer-PE)を加え、暗所で4°Cで15分間インキュベー
トします。
- 細胞をPBSで2回洗浄し、80μLのPBSに再懸濁します。
- 20 μLの抗PE-Microビーズを加え、暗所で4°Cで20分間インキュベー
トします。
- PBSで2回洗浄し、細胞を500μLのPBSで再懸濁します。
- ソーティングカラムをMACSソーターの磁場に置き、500μLのPBSですすいでください。
- ステップ1.3.4の細胞懸濁液をソーティングカラムに加え、フロースルーを回収し、PBSバッファーで3回すすぎます。
- 磁場を除去し、ソーティングカラムから細胞を回収します。この時点で、1 mLのPBSバッファーをソーティングカラムに加え、プランジャーを一定の圧力ですばやく押して、標識細胞をコレクションチューブに駆動し、精製されたiNKT細胞を取得します。自動セルカウンターでカウントします。