カチオン性ポリマーを用いたナチュラルキラー細胞におけるウイルス形質導入の増強

要約

出典:Nanbakhsh, A., et al. デキストランはマウスおよびヒト初代NK細胞のレンチウイルス形質導入効率を高める. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、ナチュラルキラー(NK)細胞におけるカチオン性ポリマーを介したウイルス形質導入のアッセイを示しています。細胞は、蛍光タンパク質をコードするトランスジェニックレンチウイルスベクターとインキュベートされます。カチオン性ポリマーを添加すると、ウイルスが細胞に付着し、そのRNAを宿主ゲノムに統合して蛍光タンパク質を発現させることができます。蛍光を定量化して、ポリマーによる形質導入の増強を評価します。

プロトコル

1. レンチウイルスによるマウスおよびヒト初代NK細胞の形質導入

1. 5、10、および20の感染多重度(MOI)で緑色蛍光タンパク質(GFP)レンチウイルス上清の存在下、およびPb(8 μg/mL)、PS(8 μg/mL)、またはデキストラン(8 μg/mL)の存在下で、0.5 × 10⁵/mLの培地で24ウェルプレートにマウスまたはヒト初代NK細胞を懸濁します。
2. プレートを1,000 × gで60分間遠心分離します。
3. 上清をデカントせずに、5.2%_CO2を注入した37°Cのインキュベーターで細胞を一晩(16〜18時間)培養します。
4. 10 mLのPBSで洗浄し、インターロイキン2(IL-2、300 U / mL)の存在下で、完全なロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地2 mLに再懸濁します。
5. 形質導入されたNK細胞を7日目にフラスコを軽くたたいて採取します。
   1. 96ウェルの高タンパク質吸収ポリスチレンプレートを2.5 μg/mLの抗NKG2D mAbで一晩コーティングすることにより、プレート結合抗ナチュラルキラーグループ2D(NKG2D)(A10)モノクローナル抗体の滴定濃度で回収した細胞を活性化します。
   2. 各ウェルを100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄してから、初代NK細胞を添加します。
6. 活性化後16〜18時間の間にマルチチャンネルピペットを使用して培養上清を回収し、インターフェロンガンマ(IFN-γ)などのサイトカインを定量します。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットに付属の組換えサイトカインを使用して、標準曲線を作成します。
7. アネキシン-V/7-アミノ-アクチノマイシンD(7-AAD)染色を用いてNK細胞の生存率を試験し、フローサイトメーターを用いて形質転換されたNK細胞のうち壊死細胞の割合を決定します。
   1. このアッセイを行うには、形質導入の4日後にマウス細胞とヒトNK細胞を回収し、10 mLの冷PBSで500 × gでそれぞれ5分間2回洗浄し、Annexin-V(PE)/7-AADキットでインキュベー
   トします。
8. 適切なフローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを解析します。生細胞集団を選択し、ウイルス形質導入の尺度としてGFP(フルオレセインイソチオシアネート[FITC]チャネル)の発現を分析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デキストラン	シグマ・アルドリッチ	90勝64敗91分9秒
ポリブレン(Pb)	シグマ・アルドリッチ	TR-1003
硫酸プロタミン(PS)	シグマ・アルドリッチ	P3369
RPMI1640	コーニング	10-040-CV
インターフェロンガンマ(IFN-γ)	eバイオサイエンス	14-7311-85
プロピジウムロジド染色溶液	BDの	51-66211Eメール
リポフェクタミン3000	サーモフィッシャー	L3000015
イソフルラン	フェニックス	NDCの57319-559-05
293T細胞	ATCCの	CRL-3216
T75フラスコ	コーニング	430641ユー
ELISAキット	エバイオサイエンス	00-4201-56