$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>注:すべての手順は手袋を着用して行ってください。細胞の汚染を防ぐために、層流フードの下ですべてのトランスフェクションステップを実行します。mRNAを扱う前に、ピペットなどのすべての機器とすべての表面を70%エタノールおよび/またはRNAse分解界面活性剤で洗浄してください(材料表)。すべての反応チューブがRNAseフリーで無菌であることを確認してください。希釈には、滅菌済みのRNAaseフリーの水のみを使用してください。フィルター付きのピペットチップのみを使用してください。ピペットチップは、ピペッティングステップごとに交換してください。
1. DNAテンプレートの生成
>注:このプロトコルを使用したin vitro mRNA転写のDNAテンプレートは、RNAポリメラーゼのドッキングを可能にするためにT7プロモーター配列を含んでいなければなりません。目的のタンパク質のDNA配列を含むプラスミドが、目的の配列のすぐ上流に正しく配向されたT7プロモーター配列をすでに含んでいる場合、プラスミドの直鎖化(ステップ1.1.を参照)を行う必要があります。それ以外の場合は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、ステップ1.2を参照)により、目的の配列にT7プロモーターを結合します。
- T7プロモーター含有プラスミドの線形化
- 正しい配向のT7プロモーター配列をすでに含むプラスミドを、目的の配列の終止コドンの下流を切断する制限酵素による消化により直鎖化します。そうしないと、目的のシーケンスの後に転写が適切に終了しません。
注:鈍い端または5フィートのオーバーハングを残す制限酵素を使用するのが最善です。
- アガロースゲル電気泳動による未消化プラスミドDNAと消化プラスミドDNAの完全直鎖化を確認します。
- DNA 精製キットを使用して、in vitro mRNA 転写の DNA テンプレートとして使用する前に、直鎖状プラスミド DNA を精製します (材料表)。
- PCRによるT7プロモーターの取り付け
- 次の成分を含むフォワードプライマーを使用します（5'から3'までの指示された順序で：プロモーターの約5 bp上流（例えば、GAAAT））T7プロモーター配列（TAATACGACTCACTATAG））転写効率向上のための2つの追加G））開始コドンを囲むプラスミド配列と相同な標的配列特異的部分><（）
手記： これは、KOZAK配列と開始コドンの上流3〜6 bp、KOZAK配列と開始コドン(通常はGCCACC ATG G)、開始コドンの下流12〜18 bpから構成されるべきである。目的の配列にKOZAK配列または開始コドンがまだ含まれていない場合は、プライマー配列にこれらを含めるだけで、このステップでこれらを結合できます。
- フォワードプライマーのtmは、ターゲット配列と相同な部分のみを考慮して計算してください。
- ダイマー/ヘアピン形成を評価するには、プライマー配列全体を使用しますが、これは簡単に50 bpを超える可能性があります。
- 終止コドンの下流のどこかにあるリバースプライマーを使用します.
注:目的の配列に終止コドンがまだ含まれていない場合は、プライマー配列に含めるだけで、このステップで結合できます。
- フォワードプライマーとリバースプライマーを使用して、プルーフリーディング付きのハイフィデリティポリメラーゼを使用してPCRを実行します(材料表)。
- アガロースゲル電気泳動による単一製品の生成とアンプリコンサイズの確認(例:1%アガロースゲルと100V定電流を使用)。
- DNA精製キットを使用して、in vitroメッセンジャーリボ核酸(mRNA)転写用のデオキシリボ核酸(DNA)テンプレートとして使用する前に、PCR産物を精製します。
2. mRNAの生成
- in vitro mRNA転写キットのすべての成分を解凍します(材料表を参照)。ボルテックスを5秒間、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。使用するまで氷の上に置いてください。
- 0.5 mL の微量遠心チューブで in vitro mRNA 転写用の反応ミックスを次の順序で調製します (総容量 40 μL): 20 μL の 10x アンチリバースキャップアナログ/ヌクレオシド三リン酸 (ARCA/NTP) ミックス (in vitro mRNA 転写キットに含まれる) 20 μL の 10x アンチリバースキャップアナログ/ヌクレオシド三リン酸 (ARCA/NTP) ミックス (in vitro mRNA 転写キットに含まれる); 0.25 μL の 5-メチル-シチジン三リン酸 (5-mCTP) (最終濃度 (f.c.) は 1.25 mM ですミリメートル;総UTPの50%)。X μL の DNA テンプレート;2 μL の T7 RNA ポリメラーゼミックス (in vitro mRNA 転写キットに含まれています);Y μL の RNAse フリー H2O.
注:Xは、少なくとも1μgのDNAを含む容量です。例えば、625 ng/μLのストック溶液から1.6 μLです。Yは、総容量40μLまでの予備容量です。
- ボルテックスを5秒間、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。37°Cで400rpmの30分間、サーマルミキサーでインキュベートし、in vitro転写を行います。
- 次に、2 μLのDNase Iを反応ミックスに直接加えて、テンプレートDNAを除去します。ボルテックスを5秒間、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。
- サーマルミキサーで37°C、400 rpm、15分間インキュベートします。コントロールゲルに2 μLのアリコートをセットし(ステップ3.3)、-80°Cで保存します。
- ポリ(A)テーリングの場合、以下の成分を前の反応ミックスに直接添加します（最終容量50 μLまで）10x poly(A)ポリメラーゼ反応バッファー5 μLおよびポリAポリメラーゼ5 μL）(どちらもin vitro mRNA転写キットに含まれています)。ボルテックスを5秒間、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。
- 混合物をサーモミキサーで37°C、400rpmで30分間インキュベートします。コントロールゲルに2 μLのアリコートをセットし(ステップ3.3)、-80°Cで保存します。
- mRNAの5'末端の脱リン酸化のために、以下の成分を前の反応ミックスに直接加えます（最終容量60 μLまで）3 μLのRNAseフリーH2O、6 μLの10x Antarctic Phosphatase反応バッファー、3 μLのAntarcticホスファターゼ）3 μL（60 μLの反応容量に対して15ユニット)。ボルテックスを5秒間、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。
- 混合物をサーマルミキサーで37°C、400 rpmで30分間インキュベー
トします。
- Antarctic phosphataseを80°Cで2分間インキュベートすることにより熱不活化します.
手記： 理想的には、別のサーマルミキサーを使用し、最初のミキサーが目的の温度に達するまで待たないでください。
3. mRNAの精製
- in vitroで転写したmRNAを専用のRNA精製キットを用いて精製します(材料表)。
- ステップ2.10のmRNA反応ミックスにX μLの溶出溶液を加えます。5回反転させて混ぜます。300 μLの結合溶液濃縮液を添加します。穏やかなピペッティングで5回混合します。
注:Xは、総容量100μLまでの予備容量です。例えば、60 μL mRNA反応ミックスに40 μL溶出液を添加します。
- RNAaseフリーエタノール100μLを添加します。穏やかにピペッティングして5回混合します。
- 付属の収集チューブの1つにフィルターカラムを置きます。mRNA反応ミックスをフィルターに触れずに、フィルターの中心に穏やかに移します。15,000 x gで室温(RT)で1分間遠心分離します。
- フィルターカラムを慎重に持ち上げ、収集チューブ内のフロースルーを捨てます。フィルターカラムを同じ収集チューブに戻します。
- 500 μLの洗浄液を加えます(初めて洗浄液を使用する前に、20 mLのRNAaseフリーエタノールを加えることを忘れないでください)。
- RTで15,000 x gで1分間遠心分離し、手順3.1.4-3.1.6をもう一度繰り返して再度洗浄します。
- RTで1分間、全速力(17,900 x g)で遠心分離し、フィルターカラムから残留液を除去します。収集チューブからフィルターカラムを慎重に取り出します。フィルターカラムを新しい収集チューブに入れます。
- フィルターに触れずに、50 μLの溶出バッファーをフィルターの中央に加えます。サーマルミキサーで65°Cで10分間インキュベートします。
- 15,000 x gでRTで1分間遠心分離し、フィルターカラムを取り外して廃棄します。
- 溶出されたmRNAの濃度と純度を測定するには、例えば、微量分光光度計を使用して260nmと280nmの吸光度を測定します><。
注:A260/A280比が1.8-2.1であることは、高度に精製されたmRNAを示しています。
- ステップ 2.5 および 2.7 のアリコートを変性条件下でアガロースゲル電気泳動で分析することにより、単一製品の存在、正しい転写物長、およびポリ (A) テーリングを確認します (たとえば、20 mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸 [MOPS]、5 mM 酢酸ナトリウム、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、および 20% ホルムアルデヒドを含む 1.2% アガロースゲルを使用し、20 mM MOPS で実行します。 5 mM酢酸ナトリウム、1 mM EDTA、および0.74 %ホルムアルデヒド(100 V定電流)。
- 精製したmRNAをトランスフェクションまで、-80°Cの溶出チューブに保存してください。トランスフェクションに少量のmRNAのみを使用する場合は、凍結融解サイクルが繰り返されないようにmRNAを分注してください
注:mRNAは-80°Cで約1年間保存できます。
4. マクロファージの調製
- C57/BL6マウス(同性で生後6-24週齢のマウスを使用)を子宮頸部脱臼により安楽死させる
注:同じマウスを一次マクロファージ(PM)の単離(ステップ4.2)およびBMDMの生成(ステップ4.3および4.4)に使用できます。PMの単離には、少なくとも2匹のマウスを使用してください。BMDMのみを生成する場合は、通常は1匹のマウスで十分です。
- 腹膜マクロファージの免疫磁気濃縮。
- 10 mLシリンジに0.9 x 40 mmカニューレを充填し、8 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と2 mLの空気を入れます。腹腔をPBSで洗い流します。空気はPBSの漏れを最小限に抑える気泡を形成します。
- 同じシリンジで腹膜洗浄液を迅速に採取し、50 mLの円錐形遠心チューブに移します。必要に応じて、複数のマウスの腹膜細胞を組み合わせます。細胞懸濁液を氷上に保ちます。
- 細胞懸濁液を650 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを0.2 % NaCl 5 mLに再懸濁して30秒間赤血球を溶解します。
- 1.6% NaCl 5 mL を総容量 10 mL に添加して、等張性条件を再構成します。650 x gで4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、腹膜洗浄1回あたり97.5 μLの磁気細胞選別(MCS)緩衝液(2 mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]、0.5%ウシ血清アルブミン[BSA]、PBS中)(例:3匹のマウスを洗い流した場合は、292.5 μLに再懸濁)で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液97.5 μLあたり、CD11b特異的抗体に結合した常磁性ビーズ2.5 μLを添加します(例:292.5 μLに7.5 μLを添加します)。
- オービタルシェーカーで氷上で15分間、150rpmでインキュベートします。
- 細胞懸濁液を650 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLのMCSバッファーに再懸濁します。
- 4 mLのMCSバッファーを総容量5 mLまで加え、ピペッティングで3回静かに上下させて細胞を洗浄します。
- 手順4.2.8と4.2.9をさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄手順を行います。
- 洗浄ステップ中に、LSカラムを磁気セルセパレーター(材料の表を参照)に入れます。カラムを 3 mL の MCS バッファーですすいでください
手記： 気泡はカラムを詰まらせる可能性があるため、避けてください。
- 細胞ペレットを1 mLのMCSバッファーに再懸濁します。MCSバッファー3 mLを総容量4 mLに加え、ピペッティングで3回上下させて混合します。
- 4 mLの細胞懸濁液をすすぎたLSカラムに移します.
注:繰り返しになりますが、気泡がカラムを詰まらせる可能性があるため、気泡は避けてください。
- カラムのリザーバーが完全に空になるまで待ちます。カラムの滴りが止まるまで、液体を追加しないでください。
- 3 mLのMCSバッファーをカラムに加えます。次に、カラムのリザーバーが完全に空になるまで待ちます。手順 4.2.15 をさらに 2 回繰り返します。
- LSカラムを15 mLの円錐形遠心チューブに入れます。5 mLのMCSバッファーをカラムにアプライします。2 mLの液体がカラムを通過するまで待ってから、プランジャーを使用して残りのフラクションをチューブに静かに押し込みます。
- 細胞懸濁液を650 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨てます。
- 10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)(DMEM+FCS)を添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)1 mLに細胞ペレットを再懸濁します。
- ノイバウアー計数チャンバー内のトリパンブルー溶液で計数し、DMEM+FCS中のシード細胞を培養プレートに計数することにより、生細胞の数を決定します.
注:平底マイクロタイタープレートに100,000細胞/ウェルの密度でPMを播種します。組織培養処理プレートはPMが剥離できないため、使用しないでください。代わりに未処理のプレートを使用してください。
- BMDMの生成
- ハサミを使って後ろ足の皮膚と筋肉を取り除きます。70%エタノールに短時間浸して各脚を洗います。
- 脚をはがし、大腿骨と脛骨の両端をハサミで切って開きます。
- 0.6 mm x 30 mm カニューレを充填した 5 mL シリンジに 5 mL の超低エンドトキシン (VLE) RPMI 1640 を充填し、開いた骨から骨髄を培養皿に洗い流します。
- 必要に応じて、手順4.3.1〜4.3.3を繰り返して、複数のマウスの骨髄を結合します。骨髄を50mLの円錐形遠心チューブに移します。
- 骨髄懸濁液を650 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを5 mLの赤血球溶解バッファー(8.3%塩化アンモニウム、NH4Cl、0.1 M Tris)に再懸濁し、室温で5分間インキュベートして赤血球を溶解します。
- 細胞懸濁液を650 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 10% FCS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1% HEPES、1% ピルビン酸ナトリウム、および 10 ng/mL 組換えマクロファージ コロニー刺激因子 (M-CSF) (RPMI+++++) を添加した VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培地 1 mL に細胞ペレットを再懸濁します。
- 4 mLのRPMI+++++を合計5 mLに加えます。.
マウス- 1匹につき、カム付き92 mm x 16 mmの未処理ペトリ皿5枚(材料表を参照)を、7 mLのRPMI+++++培地にピペットで入れて調製します。
- 1 mLの細胞溶液を調製した5つの培養皿に移し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
- 4日後、4mLのRPMI+++++を加えて細胞を給餌します。6〜7日後、骨髄細胞は完全にBMDMに分化します。
- BMDMの収穫
- 培養皿から培地を完全に取り除きます。各皿に5 mLの温かい0.2 mM EDTAをPBSで加えます。
- セルスクレーパーでプレート全体をそっとこすり落とし、BMDMを取り外してください。細胞懸濁液を50 mLの円錐形遠心チューブに混ぜ合わせます。
- 5つの皿すべてを再度洗い流します。5つのディッシュすべてに、PBSで同じ量の温かい0.2 mM EDTAを5 mL使用します。この細胞懸濁液を前のステップの懸濁液と組み合わせます。
- 細胞懸濁液を650 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 10% FCS、1% HEPES、1% ピルビン酸ナトリウム、および 10 ng/mL 組換え M-CSF を添加した 1 mL の VLE RPMI 1640 培地 (RPMI++++) に細胞ペレットを再懸濁します。
- ノイバウアー計数チャンバー内のトリパンブルー溶液で計数し、RPMI++++で培養プレートに細胞を播種することにより、生存細胞の数を決定します.
手記： BMDMを平底マイクロタイタープレートで最大50,000細胞/ウェルの密度で播種します。組織培養処理プレートは、BMDMがほとんど剥離できないため、使用しないでください。代わりに未処理のプレートを使用してください。
>5. マクロファージのmRNAによるトランスフェクション
- mRNAトランスフェクションバッファーの必要量を計算します。
手記： 必要なmRNAトランスフェクションバッファーの量はウェルサイズによって異なります:6ウェルプレートでのトランスフェクションには200 μL、12ウェルプレートでは100 μLを使用します。ピペッティングロスのため、常に少しの予備容量を追加してください(ただし、mRNAの過度の希釈を防ぐために、多すぎないようにしてください)。例えば、4 x 100 μL = 400 μL ではなく 450 μL を使用して、12 ウェルプレートの 4 ウェルにトランスフェクションします。
- mRNAトランスフェクション試薬の必要量を計算します。mRNAトランスフェクション試薬は1:50の比率で添加されます。例えば、最終容量が450 μLの場合、9 μLのmRNAトランスフェクション試薬が必要です。
- 必要なmRNAの総量を計算します。効率的なトランスフェクションには、マクロファージ100,000個あたり少なくとも100 ngが必要であり、200 ngはさらに効果的です(例えば、400,000個のマクロファージをトランスフェクションするには、800 ng mRNAを使用します)。
- 計算されたmRNAの必要量に、トランスフェクションが必要なウェルの総数を掛けます(例えば、それぞれ400,000個のマクロファージを持つ4つのウェル:すべてのウェルで合計4 x 800 ng = 3,200 ngのmRNAが必要です)。例えば、mRNAストックが426.8 ng/μLの場合、それぞれ400,000個のマクロファージを含む4つのウェルを最適にトランスフェクションするには、7.49 μLが必要です。
- mRNAトランスフェクションバッファー(ステップ5.1)の計算容量からmRNAトランスフェクション試薬(ステップ5.2)とmRNA(ステップ5.3)の容量を差し引いた量を反応チューブに加えます。たとえば、450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL です。
- mRNAストックを解凍し、溶出チューブを穏やかに反転させて混合します。mRNA反応バッファー(上記の例では、433.51μL中7.49μL)を用いて、計算された量のmRNAを反応チューブに加えます(ステップ5.3)。
- ボルテックスを5秒間、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。
- mRNAトランスフェクション試薬を5秒間ボルテックスし、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。
- mRNAトランスフェクションバッファーとmRNA(上記の例では9 μLのmRNAトランスフェクション試薬)が入った反応チューブに、計算された量のmRNAトランスフェクション試薬(ステップ5.2)を加えます。
- トランスフェクションミックスを5秒間ボルテックスし、2,000 x gで2秒間スピンダウンします。
- 室温で15分間インキュベートします。
- その間、マクロファージの培養培地を新鮮で温かい培地と交換します(ステップ4.2.18.および4.4.5を参照)。
- インキュベーションステップ5.10の後、トランスフェクションミックスを、マクロファージを含むウェルにウェルのサイズに適した容量で加えます(ステップ5.1を参照)。トランスフェクションミックスをウェルの外側から中央に向かって円を描くように滴下します。
- プレートを最初に垂直に、次に水平方向に穏やかに揺さぶって、ウェル内のトランスフェクションミックスが均一に分布するようにします。次に、37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。トランスフェクションされたmRNAによってコードされるタンパク質の合成は、トランスフェクションの直後に開始されます。最良の結果を得るには、少なくとも6時間インキュベートしてください。
- インキュベーション後、(免疫)蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはイムノブロットでトランスフェクション効率を分析するか、トランスフェクションしたマクロファージを任意の実験に使用します。