混合3D培養における標的細胞排除のための近赤外光免疫療法

要約

出典:Sato, K. et al., 近赤外光免疫療法技術を用いた混合3D培養からの選択的細胞除去。J. Vis. Exp. (2016年度)

このビデオでは、近赤外光免疫療法により混合3D細胞培養から特定の細胞を選択的に除去する技術を紹介しています。この方法では、NIR光吸収剤と結合した抗体を用いて、標的細胞を正確に同定します。その後の赤外光の照射により細胞死が誘導され、標的細胞が3D培養から効果的に排除されます。

プロトコル

>注:次のプロトコルは、近赤外線光免疫療法(NIR-PIT)を使用して特定の細胞を排除するために必要な手順を説明しています。NIR-PITと細胞生存率に関するコントロールやその他の詳細は、他の場所で見つけることができます。

1. Infrared 700 (IR700) to Monoclonal Antibodies (mAb) の結合

1. 0.1 Mリン酸水素二ナトリウム(Na₂HPO₄)(pH 8.6)溶液中で、2〜5 mg/mLで目的のモノクローナル抗体を調製します。
2. 6.8 nmol の mAb と 30.8 nmol の 10 mM IR700 を 0.1 M Na₂HPO₄ 溶液 (pH 8.6) に混合し、微量遠心チューブ内で RT で 1 時間インキュベートし、アルミホイルで覆います。
3. PD-10 カラム(材料/機器の表を参照)を 15 mL PBS で 2 回洗浄します。手順 1.2 のサンプルをロードします。
4. PD-10カラムを介して、製造元の指示に従ってPBS溶出により混合物を精製します。
   注:ここでは、溶出はIR700のバンドカラーに沿っていました。300 μlのサンプルの場合、PBS溶出画分は通常2.5 mLから4.4 mLです。
5. クマシー染色によるタンパク質濃度の測定には、分光光度計を用いて595 nmでの吸収を測定します。689 nm で吸収して IR700 の濃度を測定し、各 mAb 分子に結合する蛍光色素分子の数を確認します。
   注:分光光度計を使用して、1 mAb中のIR700分子の最適な標識数を決定することが重要です。一般に、1 mAb分子中に約3分子のIR700分子がin vitroおよびin vivoの両方の研究に最適です。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)を使用して、モノクローナル抗体とIR700が結合しているかどうかを確認できます。
6. タンパク質濃度を決定した後、4°Cで保存してください。

2. 混合3D細胞培養(混合スフェロイド)の調製

1. 吊り下げ式ドロッププレートのプレートリザーバー部分に滅菌水(約1ml)を塗布します。
2. A431-ルシフェラーゼ-緑色蛍光タンパク質(A431-luc-GFP)細胞および3T3-赤色蛍光タンパク質(3T3-RFP)細胞)など、目的の細胞の種類をさまざまな比率で調製し、各サンプルには合計5,000個の細胞が含まれ、50 μlの培地に懸濁します><。 注:細胞の種類に応じて、培養培地中の目的の細胞の種類の1:100、10:100、25:100、50:100などの比率を準備します。
3. 加湿インキュベーター内の96ウェルハンギングドロッププレートで、37°Cおよび5%の二酸化炭素で混合物を5〜7日間インキュベートします。培養培地は2日ごとに交換してください。注:3D回転楕円体を正確に作成するには、3D形状を形成する前に細胞を含む液滴が簡単に落ちるので、プレートを優しく扱ってください。
4. スフェロイドの形態とサイズを倒立明視野顕微鏡で10倍〜40倍の倍率で観察します。注:細胞の種類とハンギングドロップのサイズにもよりますが、96ウェルハンギングドロッププレートで7日間のインキュベーションを行った後、スフェロイドの直径が約400〜600μmであることを確認してください。

3. 混合3D細胞培養のためのin vitro NIR-PIT

1. 吊り下げ式ドロッププレートの培地を10 μg/ml抗体-光吸収剤コンジュゲート(APC)含有培地に交換し、加湿インキュベーターで37°C、二酸化炭素5%のインキュベーターで6時間インキュベー
トします。
2. 6時間のインキュベーション後、スフェロイドを新鮮な培地(フェノールレッドフリー)で2回洗浄します。スフェロイドを、100 μlの新鮮なフェノールレッドフリー培養培地を入れたガラス底の50 mm皿に、先端を切り落とした滅菌済みの200 μLピペットチップを使用して、スフェロイドを静かに移します。各皿に1つの回転楕円体を置きます。
3. 倒立明視野顕微鏡でスフェロイドを観察し、形態の変化を検出します。光学レポーター(GFPやRFPなど)を観察するには、次のフィルター設定で蛍光顕微鏡を使用します:GFP - 469 nm励起フィルター、および525 nm蛍光フィルター。RFP - 559 nm励起フィルタ、および630 nm発光フィルタ。
4. 照射するガラス底皿の上に発光ダイオード(LED)を置きます.
   注:スフェロイドは、顕微鏡または層流フード内でNIR光を照射できます。
   1. NIR光のパワー密度を光パワーメーターで測定します。この測定法に従って、波長670〜710nmの光を2J/cm².
      で発光する発光ダイオード(LED)を介してNIR光を照射します 注意: LEDライトは、最大で約5インチの深さまで透過できます。NIR-PIT の細胞毒性効果は、電力密度や曝露時間に関係なく、特定のエネルギーにのみ依存します。
5. 照射後、スフェロイドを50 μlの新鮮培地を入れた新しい吊り下げ式ドロッププレートに移し、加湿インキュベーターで37°C、二酸化炭素5%のインキュベーターで1日間インキュベー
トします。
6. 滅菌済みの200 μLピペットチップを使用して、100 μlの新鮮培地(フェノールレッドを含まない)を入れたガラス底皿にスフェロイドを静かに移します。NIR-PITの1日後に、ステップ3.3で説明したフィルター設定を使用して、蛍光顕微鏡でスフェロイドを観察します。
   1. 最終濃度2 μg/mlのヨウ化プロピジウムを培地に添加するか、蛍光顕微鏡を用いて細胞質GFP蛍光を消失させることにより、死細胞を検出します(図1B)。
7. ターゲットセルが完全に除去されない場合は、手順3.1〜3.6を繰り返します。

結果

図 1.3D細胞スフェロイド(A431-luc-GFP細胞と3T3-RFP細胞の混合スフェロイド)における標的細胞の排除。(A)NIR-PIT(2J/^cm2)レジメンを示す。(B)混合3Dスフェロイドにおいて、非標的細胞に害を及ぼさずにNIR-PITを完全に排除した標的細胞(A431-luc-GFP)(3T3-RFP)を繰り返した。(C)ルシフェラーゼ活性(RLU比)の定量化により、標的細胞の完全な排除が示されました(各グループにおけるn=10個のスフェロイド)。データは平均± s.e.m.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IRDye 700DX エステル赤外線染料	LI-COR Bioscience(米国ネブラスカ州リンカーン)	〒929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH(米国ミズーリ州セントルイス)	S9763
Sephadex G25カラム(PD-10)	GEヘルスケア(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)	〒17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus タンパク質アッセイ	Thermo Fisher Scientific Inc.(米国マサチューセッツ州ウォルサム)	PI-23200
Perfecta3D 96ウェルハンギングドロッププレート	3D Biomatrix Inc (米国ミシガン州アナーバー)	HDP1096-8
光パワーメーター	Thorlabs(ニュートン、ニュージャージー州、米国)	PM100
LEDディスプレイ:L690-66-60	Marubeni America Co.(米国カリフォルニア州サンタクララ)	L690 - 66から60
Vectibix(パニツムマブ)	アムジェン社(米国カリフォルニア州サウザンドオークス)
35mmガラス底皿、皿サイズ35mm、井戸サイズ10mm	Cellvis (米国カリフォルニア州マウンテンビュー)	D35-10-0-N

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