サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. HISマウスの作出
- BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) マウスのマウス飼育
手記：この株は、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー(NK)細胞を持たず、非常に免疫不全です。したがって、日和見感染を防ぐためには、厳格な対策を講じる必要があります。トリメトプリムとスルファジアジンを含む食事でコロニーを維持し、通常の食事と交互に2週間のスケジュールで行います。可能な限り最高レベルの予防措置の住宅部屋に維持します(たとえば、アクセスが制限されたバリアシャワー施設)。
- BALB/c -Rag2null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) および BALB/c Rag2null Il2RγCnull SirpaBalb/c (BRG) ホモ接合マウスのコロニーをブリーダーとして維持します。
- BRGSN/N×BRGB/Bを繁殖させてBRGSB/Nの子犬を作製し、ヒト幹細胞のレシピエントとして使用します。このコロニーでは、BRGSB/NはBRGSN/Nよりも健康で、同等のレベル(BRG以上)で生着しています。
- 臍帯血(CB)からのCD34+ヒト幹細胞の単離
手記：この手順には抗生物質は使用されません。したがって、優れた滅菌技術が不可欠です。
- 50 mLコニカルチューブラック、15 mLコニカルチューブ3本、50 mLコニカルチューブ10個~10本を滅菌バイオセーフティキャビネット(BSC)に入れます。採血バッグに70%エタノールをスプレーし、BSCで乾燥させます。
- CB 密度グラジエント単離 = CB 容量/15 に必要な 50 mL コニカルチューブの数を計算し、切り上げて偶数チューブ数にします。チューブあたりの血液量 = CB ボリューム/チューブ数を計算します。CBバッグから各円錐形のチューブに血液を注意深く注ぎます。これは、チューブあたり最大15mLです。自動ピペッターと25 mLの血清ピペットを使用して、ピペッティングで上下に動かして血液を滅菌PBSと1:1で混合します。
- 低速の自動ピペッターと10 mLの血清ピペットを使用して、界面を乱すことなく、室温(RT)1.077 g/mLの密度勾配溶液(材料の表を参照)で血液をゆっくりとアンダーレイします。ピペットの先端がチューブの底に触れないようにしてください。すべてのチューブに対して繰り返します。次に、850 x gで30分間遠心分離し、ブレーキをかけずにRTで遠心分離し、密度勾配が維持されるようにします。
- 1.077 g/mL の密度勾配の上にある細胞のバフィーコートを、曇った白い層として視覚化します。25 mLの血清ピペットと自動ピペットツールを使用して、バフィーコートの約10 mLまでプラズマ層を取り外して廃棄します。.
- 滅菌トランスファーまたは血清学的ピペットでバフィーコートを収集します。ピペットをへらのように使用して、球根を離す(またはゆっくりとピペッティングする)ときに円錐管の側面から細胞をこすり落とします。2本の50 mLコニカルチューブのバフィーコートを1本の新しい50 mLコニカルチューブに組み合わせます。
- 2%ウシ胎児血清(FBS)を含む45mLの滅菌ハンクス平衡塩溶液(HBSS)を各円錐管に注いで細胞を洗浄します。室温で360 x gで11分間遠心分離します。
- すべてのチューブで洗浄媒体をペレットまで吸引します。10 mLの血清ピペットと自動ピペッターを使用して、2% FBSを含む10 mLのHBSSに最初のペレットを再懸濁します。各ペレットを同じ10 mLのHBSSに再懸濁し、各チューブをさらに10 mLのHBSSですすいで、すべての細胞を1つのチューブに集めます。
- 2%FBSを含む滅菌HBSS45mLをコニカルチューブに注ぎます。360 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
- 洗浄バッファーを細胞ペレットまで吸引し、ペレットを20 mLの磁気細胞セパレーターバッファーに再懸濁します(材料の表を参照)。小さなアリコートを取り出して、血球計算盤でメチレンブルーの1:20希釈で細胞をカウントします。青と白のセルの数を追加します。360 x gで4°Cで10分間遠心分離します
手記：このプロトコルは、磁気ビーズ技術を使用しています(資料の表を参照)。このプロトコールは、CD34+幹細胞の十分な純度と収量で、任意の細胞分離技術で使用するために変更することができます。
- 上清を吸引し、臍帯血から単離したCD34+細胞ペレットを1 x 108細胞あたり300 μLの磁気細胞セパレーターバッファーに再懸濁します。最初に100 μLのFc受容体(FcR)ブロッキング試薬を添加し、次に1 x 108細胞あたり100 μLのCD34+磁気ビーズを添加します。4°Cで30分間インキュベートします(氷なし)。
- 1 x 108細胞あたり5 mLの磁気細胞セパレーターバッファーを添加し、360 x gで4°Cで10分間遠心します。洗浄ステップを繰り返し、ペレットを1 x 108細胞あたり500 μLの磁気細胞セパレーターバッファーに再懸濁し、「未分画」とラベル付けされた15 mLのコニカルチューブに入れます。
- さらに2本の15 mLコニカルチューブに「CD34-」と「CD34+」をラベル付けします。3本の15 mLコニカルチューブ(未分画、CD34-、CD34+)をそれぞれ冷却ラックのスロットA1、B1、C1に配置します(材料の表を参照)。BSC内の自動磁気セルセパレーター(材料表を参照)で2カラムのポジティブセレクションプログラムを使用して、メーカーの機器の指示に従ってセルを分離します。
- CD34+ヒト幹細胞の増殖と凍結
- 回収したCD34+細胞懸濁液(2 mL)10 μLを血球計算盤スライド上に分注し、10倍の拡大鏡で細胞をカウントします。細胞数に2 x 104を掛けて、CD34+細胞の総数を計算します。CD34+細胞の総数を250,000で割って、凍結するバイアルの数を計算します(in vitro増殖前のマウスの子犬あたり50,000細胞)。
- CB 培地 Iscove の 10% ウシ胎児血清(FCS)(さらに損失のろ過用に 1 mL を追加)に 40 ng/mL 幹細胞因子、20 ng/mL FMS 様チロシンキナーゼ 3 リガンド(Flt3L)、10 ng/mL インターロイキン-6(IL-6)を添加し、0.22 μm フィルターを通過させます。CD34+細胞をCB培地100,000/mLで再懸濁し、37°Cでインキュベートします。3日目に、細胞を含むフラスコとサイトカインを含むCB培地に、サイトカインを含まない同量のCB培地を追加します
手記：これらのサイトカインをCB培地に添加すると、CD34+細胞の生存と増殖が促進され、分化が防止されます。
- 5日目に増殖したCD34+細胞を回収します。細胞懸濁液を上下にピペットで動かし、50 mLのコニカルチューブに集めます。フラスコの底を覆うのに十分なCBメディウムを追加します。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底全体をこすり落とします。すべての培地を同じ50 mLチューブに集め、360 x gで11分間遠心分離します。
- 細胞を2 mLのCB培地に再懸濁します。ピペットからの最後の一滴を96ウェルプレートに保存してカウントします。細胞をトリパンブルーで1:1に希釈し、血球計算盤に10μLを加えてから、4つの象限から細胞をカウントして平均化します。細胞数に4×104を掛けてCD34+細胞の総数を計算し、生存率を記録します。
- n+1 mL の凍結培地を作成します(n はステップ 1.3.1 で計算した凍結バイアルの数です)。FBSに10%(v / v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加して凍結培地を調製し、氷上に保管します。クライオバイアルにCB#、CD34+ d5、および日付を標識します。
- CD34+細胞を360 x gで4°Cで10分間スピンダウンし、培地をペレットまで吸引し、細胞ペレットを凍結培地に再懸濁します。1 mLの細胞懸濁液を各バイアルに分注し、残りをバイアル間で均等に分割します。バイアルを4°Cに冷やしたイソプロパノール細胞フリーザーに加え、-80°Cに置き、液体窒素に移して>90日間保存します。
- マウスの子犬への照射
- 生後1〜3日でBRGSB / Nの子犬をパッド付きのオートクレーブ処理されたプラスチックの箱に集めます。子犬と一緒に少量の寝具を追加します。箱にケージ番号と子犬の数をラベル
付けします。
- 照射器を300ラドの線量で設置し(材料の表を参照)、子犬の箱を照射器にセットし、300ラドに曝露します。子犬をケージに戻し、山に置き、寝具で覆います。
- 子犬の注射とCD34+細胞の調製
- CD34+細胞の調製は、照射後~3時間で開始します。50 mLのコニカルチューブで10 mLのCB培地を温めます。滅菌BSCですべてのステップを実行します。
- 注入する子犬4〜6匹ごとに、in vitroで拡大および凍結したCD34+細胞のバイアルを1つ回収します。55°Cで急速に解凍し、少量の氷が見えるまで解凍し、温めたCB培地に細胞を加えます(バイアルはまだ触ると冷たくなければなりません)。1 mLの培地を使用して各バイアルをすすぎ、細胞を360 x gで4°Cで12分間遠心します
注:55°Cでの急速な融解は、37°Cでの融解よりも優れた細胞生存率(90%-95%)をもたらすことがわかりました。
- 媒体を慎重に吸引します。(小)ペレットを2 mLのCB培地に再懸濁し、穏やかに混合し、~30 μLの細胞懸濁液を計数プレートの1つのウェルに加えます。トリパンブルーで1:1に希釈し、血球計算盤に10 μLを加えて、4つの象限から細胞をカウントして平均
化します。
- 細胞数に4 x 104を掛けてCD34+細胞の総数を計算し、生存率を記録します。360 x gで4°Cで12分間遠心します。
- 培地を慎重に吸引し、細胞ペレットをn+1匹の子犬あたり100μLの滅菌PBSに再懸濁して注入すると、マウスあたり250,000〜450,000個のCD34+細胞が得られます。コニカルチューブを輸送容器の氷の上に置き、子犬の注射のためにビバリウムに移動します。
- ヒートランプ、おむつ、1 mLシリンジ、18 G針、30 G針、および滅菌容器に入ったCD34 +細胞調製物をビバリウムBSCに持参します。滅菌おむつをヒートランプの下~2フィートに置きます。注入するトイレ砂の入ったケージを取り出し、BSCに入れます。
- 18Gの斜めの針でシリンジを組み立てます。円錐管の角度を針の斜角に合わせ、細胞懸濁液を穏やかに混合して引き上げます。子犬をおむつに置いて温めます(過熱に注意してください)。シリンジから空気を抜き、18 Gの針を30 Gの針と交換し、細胞懸濁液が針の先端にちょうど来るまでシリンジを慎重に押します
手記：あるいは、インスリン注射器を使用することもできます。
- 一度に1匹の子犬をヒートランプから離れたおむつの端に連れて行きます。親指と人差し指の下で子犬を横向きに固定し、顔がはっきりと見えるようにします。耳がある場所の下の頬を横切る静脈に注目してください。目に近い静脈(IV)に針を浅く挿入し、50μLの細胞をゆっくりと注入します。
- 皮下注射で気泡が発生していないか確認してください。その場合は、針をより深く挿入し、細胞の注入に進みます。成功すると、少量の血液/血腫が見えます。
- 子犬を固定したまま、さらに50μLの細胞(IV+IHの子犬あたり合計100μL)で肝内注射(IH)を行います。肝臓は、白いミルクバンドと胸郭の間の暗いスポットとして視覚化できます。注射した子犬を、注射していない子犬からさらに離れたおむつの上に置き、加熱します
手記：IV注射は、IH注射単独よりも優れた長期キメラ効果をもたらしますが、IV注射が常に成功するとは限りません。したがって、IVとIHの間で注射を分割すると、より多くのマウスへの生着が保証されます。
- すべての子犬に対して顔面静脈注射とIH注射の両方を繰り返します。血をきれいに洗い流し、子犬をケージの巣に戻し、寝具で覆います。
