皮下腫瘍が不完全切除されたマウスモデルにおける補助療法

要約

出典:Rwandamuriye, F. X. et al., (ネオ)アジュバント療法の試験のための不完全に切除された軟部組織肉腫のマウスモデル。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、皮下腫瘍が不完全に切除されたマウスモデルでのアジュバントまたは追加療法のテストを示しています。腫瘍を部分的に切除したマウスは、制御性T細胞の抗細胞傷害性タンパク質を標的とする抗体で治療され、腫瘍の再増殖を抑制し、効果的なアジュバント療法が示唆されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 細胞の接種

1. 細胞と動物の調製
   1. 細胞株が推奨培地に保持されていることを確認してください。例えば、2 mM L-グルタミン、10% ウシ胎児血清、20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、0.05 mM 2-メルカプトエタノール、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培地で WEHI 164 細胞株を維持します>< 手記：細胞を極低温保存から取り出した後、少なくとも3回から最大5回継代します。最適な細胞生存率を確保するために、細胞は70〜80%のコンフルエントな状態で分割する必要があります。腫瘍細胞株は、感染が細胞増殖を変化させ、in vivoでの免疫応答に影響を与える可能性があるため、マイコプラズマの検査を行う必要があります。
   2. 接種の前日、クリッパーを使ってマウスの右下脇腹を剃ります
      手記：この実験では、8〜12週齢の正常体重(16〜22グラム)の雌BALB / cマウスを使用しました。
   3. 接種の日に、トリプシン化により70〜80%がコンフルエントになったときにWEHI 164細胞を採取します。
      1. 組織培養フラスコから培地を吸引し、滅菌リン酸緩衝液(1x PBS)を添加して、ウシ胎児血清(FBS)の残りの痕跡を除去します。
      2. 組織培養フラスコからPBSを吸引します。0.05%トリプシン(T75フラスコ用)を3mL加え、フラスコを渦巻かせて、細胞入りフラスコの全面がトリプシンで覆われるようにします。
      3. フラスコを37°C、5%CO₂インキュベーターで3分間インキュベートし、フラスコの側面を軽くたたいて細胞が外れたかどうかを定期的にチェックします。
      4. 細胞培養インキュベーターからフラスコを取り出し、FBSを添加した培地5 mLを加えてトリプシンを中和します
         手記：細胞を必要以上に長くトリプシンに放置すると、細胞が損傷し、細胞生存率が低下する可能性があるため、使用しないでください。
      5. 懸濁液を複数回ピペットして、単一細胞懸濁液を得る。細胞懸濁液を円錐形の遠心分離チューブに移します。
      6. 細胞を350 x gで3分間回転させてペレット
      化します。
   4. 細胞を1x PBSで3回洗浄します。
      1. 50 mLの滅菌済み1x PBSに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を上下にピペッティングして細胞を洗浄します。細胞を350 x gで3分間回転させてペレット
      化します。
      2. 上清を吸引し、15 mLの滅菌済み1x PBSに細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を上下にピペッティングして細胞を洗浄します。細胞を350 x gで3分間回転させてペレット
      化します。
      3. 上清を吸引し、正確に10 mLの滅菌済み1x PBSに細胞を再懸濁します。ステップ1.1.4.2と同様に細胞を洗浄し、少量(約100 μL)の細胞懸濁液を遠心チューブに移してカウントします。細胞を350 x gで3分間回転させてペレット
      化します。
   5. トリパンブルー排除法を用いて、血球計算盤または自動セルカウンターを用いて細胞数を決定します。細胞を滅菌済み1x PBSに5 x 10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁します。細胞懸濁液を氷上に保管します。
      手記：腫瘍細胞の生存率は、再現性のある腫瘍増殖を確保するために、80%以上である必要があります。
2. 皮下接種
   1. 細胞懸濁液を完全に混合し、シリンジに26G針で100μLの細胞懸濁液(5×10、⁵細胞)を滅菌した1x PBSに充填します。次のシリンジをロードする前に、セルの混合を繰り返します.
      手記：生存率を維持するために、手順全体を通して細胞を氷上に保ちます。
   2. マウスを適切に拘束し、右下の側面にアクセスできるようにします。剃毛した右下の脇腹にマウスを皮下接種します
      手記：皮膚の下に見える針を少し持ち上げて、接種が腹膜にないことを確認します。接種後、皮膚の下に泡状のしこりが形成されるはずです。
   3. 該当する倫理承認の要求に応じてマウスを監視し、腫瘍が約^50mm2のサイズに成長したときに外科的切除を行います。

2. 腫瘍の部分外科的切除

>注:このプロトコルには2人の研究者が必要です。1人は外科手術用(SURGEON)、もう1人はマウスモニタリング用(ASSISTANT)です。

1. 手術のセットアップ
   1. 接種後12日目に、腫瘍が約50 mm²のサイズに達した場合、手術の30分前に、首筋に100μL(0.1 mg / kg)のブプレノルフィンs.c.をマウスに投与します。
   2. 手術部位にはベンチコートを敷いたヒートパッドを設置し、麻酔用のノーズコーンを設置します。手術器具は使用前に滅菌し、各動物間ではヒートビーズ滅菌器を使用して滅菌し、使用前に器具を冷まします。次の手術器具を清潔で手の届くところに用意してください。クロルヘキシジン、綿棒、ガーゼ、アイジェル、湾曲した鉗子 2 本、はさみ、クリップ アプリケーター、クリップ リムーバー、クリップ リフィル (図 1A、1B)。
   3. 加熱チャンバーを37°Cに温め、回収のために別のヒートパッドを設置します(図1C)。滅菌したツールをオートクレーブパッドなどの滅菌面に置きます。
2. 麻酔
   1. マウスを誘導室に置き、呼吸数が毎分約60呼吸(1秒あたり1回)に遅くなるまで、4%イソフルラン(1L/minの流量で100%酸素中4%)でマウスに麻酔をかけます(これには通常<1分かかります)
      手記：マウスをチャンバー内に長時間放置すると、窒息や死に至る可能性があるため、放置しないでください。麻酔下のマウスは一度に1匹だけにしてください。
   2. マウスを手術台のヒートパッドに移し、マウスの鼻をノーズコーンに置き、100%酸素中に3〜4%イソフルランを0.5L/minの流量で麻酔状態を維持します。呼吸数を監視して、麻酔の深さが維持されていることを確認します。
      手記：ASSISTANTは、手術中、マウスの呼吸を監視して、正しい麻酔レベルが維持されていることを確認する必要があります。呼吸が遅くなりすぎる場合は麻酔薬の濃度を下げ、麻酔の深さが浅すぎる場合は麻酔薬の濃度を上げます。マウスがあえぎ始めたら、マウスをノーズコーンから取り外し、麻酔薬の濃度を下げ、呼吸が正常になるまで待ってから、再びノーズコーンに置きます。.
   3. 「ピンチテスト」と「角膜反射テスト」を行い、手術を開始する前にマウスが完全に麻酔されていることを確認してください。
      手記：マウスの任意の部分の動きは、マウスが完全に麻酔されていないことを示しています。動物には、麻酔薬の濃度を上げることにより、すぐに追加の麻酔薬を投与する必要があります。.
   4. マウスの目を少量の眼科用ジェルで覆い、目の乾燥を防ぎます。
3. 手術
   1. 手術部位をアルコール性クロルヘキシジンで3回綿棒で拭きます。鉗子とハサミを使用して、腫瘍から3 mm離れた背側に沿って1 cmまっすぐに切開します(図2A、2B).
      手記：すべてのマウスで切開部を1cmに標準化すると(定規を使用)、マウス間の創傷治癒を均一に評価できます。切開部を腫瘍から3mm離して位置することで、創傷からの漏れなしにその後の腫瘍内補助療法が可能になります。
   2. ピンセットを使用して、腫瘍と腹膜の間の顔面と皮下脂肪組織を引き離します。皮下腫瘍は通常、皮膚側に付着しています。
   3. ピンセットを使用して腫瘍を抱える側の皮膚を優しく保持して傷口を開き、腫瘍を「反転」して外側に見えるようにします(図2C、2D).
      手記：減量する腫瘍の切片は、創傷を閉じるのに十分な皮膚を持つために開口部に最も近いべきである。腫瘍を切除する際は、皮膚を切らないように注意してください。
   4. はさみを使用して、開口部に最も近い腫瘍の基部から始めて、腫瘍嚢を半分に切り取り、腫瘍嚢を取り除きます。
   5. 50%デバルク手術の場合は、腫瘍の中央を横切って切り取ります。湾曲した鉗子を使用して、切除する腫瘍の部分をすくい上げます(50%);減量されたエリアから残骸をすくい上げます。
   6. 75%のデバルクの場合は、上記のパート2.3.5のように50%の腫瘍デバルクを実行します。次に、腫瘍の残りの50%を半分に切り取り、上記のように湾曲した鉗子を使用して腫瘍の25%をすくい上げます。
4. 手術部位を閉じる
   1. 残りの腫瘍を皮膚の下に戻し、鉗子を使用して皮膚フラップを一緒に引っ張り、傷に沿って皮膚を並べます。
   2. 創傷の端から5mmのところで皮膚を一緒に保持し、鉗子に最も近い側から始めて、外科用クリップを使用して創傷を閉じます。必要な数のクリップを適用して、下にある組織が露出しないようにします。一般的に、クリップ間には2mmの隙間を空けて3〜4個のクリップが適用されます
      手記：適切に適用されていないクリップがある場合は、クリップリムーバーを使用してクリップを削除し、新しいクリップと交換します。
5. マウスの回復
   1. マウスを暖かい(37°C)加熱チャンバーに入れて回復させます。
   2. マウスのケージをヒートパッドに置きます。マウスが麻酔薬から回復するまで加熱チャンバー内でマウスを監視し(覚醒して歩行)、マウスをケージに戻します。マウスがより活発になるまで、ケージをヒートパッドにさらに10分間置いておきます。
   3. マウスに濡れた柔らかい食べ物を与えます。手術の1時間後にマウスの回復を監視し、クリップが所定の位置に留まっていることを確認します。ケージがヒートパッドの半分オンまたはオフになっていることを確認して、動物が無人で温度を自己調整できるようにします。
   4. 手術の6〜8時間後(一日の終わり)に0.1 mg / kgのブプレノルフィン(首筋に100μLの皮下)をマウスに投与します。.翌朝早くマウスをモニターし、マウスに0.1 mg / kgのブプレノルフィン(首筋に100 μLの皮下投与)を再度投与します。.必要に応じて、より多くのウェットフードを与えます。
   5. 次の7日間、マウスを毎日監視します。クリップは、クリップリムーバーを使用して7日後に取り外すことができます。
6. アジュバントまたはネオアジュバント治療
   1. マウスを周術期に(ネオ)アジュバント療法で治療します。これは、目的の治療に応じて、いつでも可能です。
   2. 例えば、接種後15日目に抗CTLA-4抗体4抗体100μgを腹腔内(i.p.)で1回投与し、接種後15日目、17日目、19日目に200μgの抗PD-1抗体を3回投与してマウスを治療します。

結果

図1:手術セットアップの代表的な画像。(A)手術器具(ステップ2.1に記載)と麻酔器を示す手術セットアップの全体像。(B)簡単に手の届くところにあるすべての材料を示す手術台のスナップショット画像。(C)マウスを回復させるための加熱チャンバーと加熱パッド。

図2:部分的な腫瘍デバルク技術の代表的な写真。(A) 手術前の腫瘍が50 mm²の大きさの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
26ゲージ0.5mLインスリンシリンジ	ベクトン・ディキンソン(オーストラリア)	326769	何一つ
2-メルカプトエタノール	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	21985023	何一つ
麻酔ガスマシン	ダーバル獣医、オーストラリア	商品コード: 2848	何一つ
アンチCTLA-4	BioXcell, アメリカ	BE0164	何一つ
アンチPD-1	BioXcell, アメリカ	BP0273	何一つ
ブプレノルフィン塩酸塩注射液、0.3mg/mL	RBヘルスケアUKリミテッド、英国	55175	処方箋の注文
クロルヘキシジンサージカルスクラブ4%	ペリゴオーストラリア、オーストラリア	CHL01449F(スクラブ	何一つ
ウシ胎児血清	CellSera, オーストラリア	AU-FBS-PG	何一つ
鉗子細 10.5 cm	外科用家、西オーストラリア州	CC74110	何一つ
鉗子ファイン12cm鋸歯状	外科用家、西オーストラリア州	CC74212	何一つ
ハルステッド鉗子14 cm	外科用家、西オーストラリア州	CD01114	何一つ
加熱室	Datesand Ltd、英国	ミニサーマケージ	何一つ
HEPESの(1M)	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	15630080	何一つ
イソフルラン	ヘンリー・シャイン動物衛生、オーストラリア	商品コード: 29405	処方箋の注文
潤滑性眼軟膏	アルコン	該当なし	何一つ
ペニシリン/ストレプトマイシン1000X	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	15140122	何一つ
リン酸緩衝液 10x	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	〒70013-032	何一つ
リフレックス7mmクリップ	エイブルサイエンティフィック、オーストラリア	AS59038	何一つ
Reflex 7mm ワウンド クリップ アプリケーター	エイブルサイエンティフィック、オーストラリア	AS59036	何一つ
リフレックス創傷クリップリムーバー	エイブルサイエンティフィック、オーストラリア	AS59037	何一つ
げっ歯類のQube麻酔呼吸回路	ダーバル獣医、オーストラリア	#7885	何一つ
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアム+ L-グルタミン	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	21870092	何一つ
はさみアイリスSTR 11 cm	外科用家、西オーストラリア州	KF3211	何一つ
はさみアイリスSTR 9 cm	外科用家、西オーストラリア州	JH4209	何一つ
小型インダクションチャンバー	ダーバル獣医、オーストラリア	商品コード: 9630	何一つ
TrypLEエクスプレス1x	ライフテクノロジーズオーストラリアPtyLtd	〒12604-021	何一つ

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