マウスモデルにおけるヒト皮膚移植技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ドナーヒト皮膚サンプルの処理

>注:この移植で使用された人間の皮膚サンプルは、健康な患者の腹部から収集された大きなサンプルでした。サンプルは少なくとも15 cm x 7.5 cmである必要があります。サイズの制限は、皮膚が利用可能なマウスの数と移植片サイズの選択に影響を与える可能性があります。

1. 調製および移植前に、皮膚サンプルを低温(氷上、4°C)に維持します。ガーゼをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に浸した密閉型検体採取カップでサンプルを湿らせておきます。
   注:皮膚サンプルを4°Cで2日以上保存することはお勧めしません。ただし、皮膚サンプルが長期間保存されるレポートが存在します.
   注意：すべてのヒト組織を標準的なバイオハザード予防策で治療します。
2. 滅菌した解剖ボード上の滅菌された陰圧組織培養フードでヒトの皮膚サンプルを皮膚分刈
りする準備をします。
3. 皮膚サンプルを表皮を上にして、解剖ボードに置きます。滅菌アルコール調製パッドで表皮を拭き、次にPBSで拭きます。
4. 1.5インチの解剖Tピンで皮膚の近くのエッジを所定の位置に固定します(材料の表を参照)。
5. 皮膚試料を400μmの厚さでダーマトームし、30°〜45°の角度で前方に切断しながら一定の圧力をかけます。すべての機器固有の指示と安全対策に従ってください(資料の表を参照).
   注:ダーマトーム技術の詳細については、以前に公開されたレポートを参照してください。
6. 100 mm x 20 mmのペトリ皿を準備し、滅菌PBSに浸した滅菌ガーゼを皿の底に置きます。表皮を上にして、濡れたガーゼの上に皮膚を置きます。
7. プレートの端をシールし、半透明のシーリングフィルム(材料の表を参照)で覆い、サンプルが汚染されていないことを確認します。グラフトする前に、サンプルを4°Cで保存してください。

2. 手術前のコンディショニングと準備

1. 滅菌器具と移植用の滅菌手術ステーションを準備します。オートクレーブ処理されたペーパータオルを器具やマウスの無菌面として使用します.
   注:マウスは離乳後に移植することができますが、好ましくは8〜10週齢の間に移植されます。どちらの性別のマウスも移植できます。
2. 脱毛などの外科的準備は、手術ステーションから物理的に離れた場所で行ってください。
3. 抗GR1(材料の表を参照)を滅菌生理食塩水で1 mg / mLに希釈して調製します。.麻酔導入後に各マウスに100 μg/100 μLの抗GR1溶液を腹腔内に投与します。
4. イソフルランまたは他の制度的に承認された麻酔薬でマウスを一度に1つずつ麻酔します.
   注:イソフルランは、誘導中に3%〜5%の濃度で投与する必要があります。.マウスが動かなくなったら、イソフルラン濃度を1%〜3%に下げて、手術の期間に影響を与えます。
   1. マウスの麻酔の適切な深さをモニターし、呼吸数、つま先をつまむ反応の欠如、耳と口の適切なピンク色を観察します
      注意：適切な麻酔器具と清掃方法を使用し、イソフルラン蒸気への曝露を避けてください。.
5. マウスを加熱パッドまたは別の熱源に移します(材料の表を参照)。
6. 手袋をはめた指で眼に少量の軟膏を軽くたたくことにより、眼科用軟膏を投与します。.
7. 鎮痛剤のブプレノルフィン(0.08 mg/kg)とカルプロフェン(5 mg/kg)(材料表参照)を皮下投与し、皮膚をつまんで体と平行な角度で注射します
   注: 治療前の鎮痛剤は、施設のプロトコルに従って準備します。鎮痛薬の選択と投与に関する制度的ガイドラインに従ってください。.この研究で使用された鎮痛の方法は、ステップ 2.7 と図 1 で概説されています。
8. 抗GR1(ステップ2.4で調製)を腹腔内に投与するには、マウスの尾部をわずかに持ち上げ、腹部を露出させ、インスリン1mL(12.7mm)シリンジを使用して30°の角度で注射します。.
9. 動物に安全な電動バリカン(材料の表を参照)を使用して、マウスの背側の中央部と上部を剃ります。
10. すべての髪をきれいにし、剃った肌にたっぷりの脱毛軟膏を30〜1分間塗ります。
11. 脱毛軟膏はペーパータオルとPBSで完全に拭き取ります。

>3. 移植の手順

1. マウスを脱毛ステーションから離れた二次手術部位に移します。
2. ヨウ素スワブスティックで手術部位を円を描くように滅菌し、中央から脱毛領域の端に向かって運動します。
3. 滅菌プラスチックラップをマウスの上に置き、移植する領域のサイズよりわずかに大きいプラスチックの窓を切り取ります。
4. ドナーの皮膚の10mm×10mmの長方形の部分を切開し、メスで移植します。これを行うには、鉗子の裏側でドナーの皮膚を所定の位置にしっかりと保持し、メスで鉗子に沿って切断します。
5. 手術用ハサミを使用して、ドナーの皮膚片のサイズに一致するマウスの皮膚の長方形の領域を切り取り、移植ベッドを作成します。鉗子を使用して皮膚を体から引き離し、はさみを体から遠ざける角度にして皮膚を切って、顔面に深く切り込まないようにします。
6. ドナーの皮膚片を表皮を上にして、準備した移植片ベッドに置きます。
7. 鉗子の裏側を使用して、皮膚を操作し、ドナーの皮膚が移植床に対して完全に平らになるまで前後にスライドさせます。
8. ドナーの皮膚がマウスの皮膚と出会う場所に外科用接着剤組織接着剤(材料の表を参照)を滴下し、マウスとドナーの皮膚を鉗子で1〜2秒間保持して、接着剤が組織に付着するようにします。グラフトの端を完全に密閉し、接着剤が完全に乾くまで待ちます。
9. 以下の手順に従って、マウス(図2)に包帯を巻いてください。
   1. 移植片領域を完全に覆うのに十分な大きさのワセリンガーゼ(材料の表を参照)をカットします。
   2. 移植片をワセリンガーゼで覆い、鉗子を使用してガーゼを皮膚に軽く押し付けます。
   3. 透明なフィルムドレッシングのストリップを縦に切り取り、マウスの傷を覆うのに十分な幅になるようにします。
   4. 透明フィルムドレッシングを接着剤面を下にしてガーゼにしっかりと押し付けます。マウスをすばやく転がしてドレッシングを胴体に完全に巻き付け、呼吸を妨げずにしっかりとフィットし、すべての手足が自由に動くようにします。
   5. マウスをリカバリーケージに入れ、警戒して動き回るまで監視します。回復後少なくとも15分間、ケージの一部に熱源を提供します.
      注:動物は、回復ケージに入れてから1〜5分以内に回復することが期待されます。

図 1: 異種移植片研究に採用されたプロトコルのタイムライン。

図 2: 手術後のマウスの包帯の方法。マウスは、麻酔下でワセリンガーゼと透明フィルムドレッシングでしっかりと包まれています。(A)ワセリンガーゼは、手術創よりもわずかに大きい領域に配置されます。(B)透明フィルムドレッシングを調製する:長いストリップをワセリンガーゼよりわずかに広くカットします。透明フィルムドレッシングの接着面を覆う裏地が一部剥がれています。(C)フィルムの接着面がマウスの背面にしっかりと押し付けられ、フィルムのフロントエンドに1インチのスペースが残ります。(D)マウスを背に向けています。フィルムの張り出した前部をマウスに押し付け、裏地を取り外します。(E)マウスをフィルムにしっかりと包み込み、マウスを巻きつけると残りの支持体が取り除かれます。(F)マウスはドレッシングにうまく包まれ、腕と脚は拘束されていません。