ヒトPBMC移植ヒト異種移植マウスモデルの生成技術

要約

出典:Li, Z., et al. A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、ヒト化異種移植マウスモデルを生成するためのアッセイを実演しています。免疫不全マウスにシクロホスファミドを注射して免疫細胞の枯渇を引き起こします。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)とハイドロゲル中に混合した患者由来腫瘍細胞をマウスに皮下注射し、T細胞が浸潤した腫瘍を形成します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ヒトPBMCモデルの構築

1. シクロホスファミドを用いたNOD/SCIDマウスの骨髄切除:最適用量の決定
   1. 雌の非肥満糖尿病/重症複合免疫不全症(NOD / SCID)マウスを購入します(6-8週間).
      手記： この研究に関与したマウスはすべて雌でした。
   2. 生理食塩水でさまざまな用量(50、100、150 mg / kg)でシクロホスファミド(CP)を調製します。.食塩水中の0.8%Tween-80にジスルフィラム(DS)を125 mg / kgで調製します><。 注:異なる用量のCPを投与するマウスに等量の薬物溶液を投与できるように、異なる濃度のCPを調製しました。
   3. 動物をCP(腹腔内、i.p.)およびDS(peroral、p.o.)で1日1回、2日間治療します。CP.
      の各投与の2時間後にDS(p.o.)を与えます 注: DSはマウスのCPの尿毒性を低下させ、DSと組み合わせたCPは、CPのみで治療された動物よりも長引く好中球減少症を有することが示唆されています。.CPの投与計画は、実際の研究に先立って事前に決定する必要がある場合があり、異なる免疫不全マウス系統間でわずかに異なることがわかっています。
   4. 眼窩静脈洞から血液サンプルを採取し、0日目(1回目の投与の1時間前)、2日目(2回^目の投与の24時間後)、4日目(2回^目の投与から72時間後)に氷上のエチレンジアミン四酢酸カリウム(EDTA-K)コーティングチューブに移します。
   5. 蛍光活性化細胞選別(FACS)によるCPおよびDS治療後の骨髄切除効果を調べます。好中球として^CD11b + Ly6Cを高く、単球としてCD11b ⁺ Ly6Cを高くゲーティングするために、ラット抗マウスCD11b(M1 / 70)、ラット抗マウスLy6C(HK1.4)、およびラット抗マウスLy6G(1A8)を使用します。
   6. マウスの体重と健康状態を1週間毎日記録します。CPおよびDSの最適用量は、マウスに重篤な毒性を引き起こすことなく、好中球および単球の最大枯渇をもたらすレジメンとして決定される。
2. ヒトPBMC移植と腫瘍生着:モデルセットアップ
   1. 健康なドナーからヒトPBMCを、製造元の指示に従って密度勾配遠心分離により分離します。
   2. ステップ1.1.2および1.1.3で示されているように、マウスをCPおよびDSで前処理して、移植効率を高めます。
   3. CPおよびDSの2回目の投与から20〜24時間後に、A431細胞(ATCC、2.5 x 10⁶)および5 x 10⁶単離PBMC(50%マトリゲルを含む合計200μLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に混合)、または腫瘍断片(3 x 3 x 3 mm³、 50%マトリゲルを含む200μLのPBS)および200μLの5 x 10⁶ PBMC(生着腫瘍断片の左側と右側にそれぞれ100μL)を動物の右側に皮下(s.c.)で
   。
   4. 原発腫瘍の体積を測定し、週に2回、4〜6週間記録します.
      手記：マウスは、体重が 20% 以上減少するか、腫瘍体積が 2,000 mm³ に達するか、腫瘍が潰瘍化すると安楽死します。
   5. ガス室でマウスを二酸化炭素で安楽死させる。屠殺マウスの腫瘍組織全体を眼科用ハサミで採取し、組織学および免疫組織化学(IHC)分析のために処理します。これらの組織におけるヒトCD8、PD-1、およびPD-L1の発現を調べます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBMC分離/細胞培養
Histopaque-1077	シグマ	10771	細胞単離
DMEM	コーニング	10-013-CVRの	細胞培養
DPBSの	コーニング	21-031-CVRの	細胞培養
FBSの	コーニング	35-076-CV	細胞培養
ペニシリン-ストレプトマイシン、液体	ギブコ	15140-163	細胞培養
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	ギブコ	25200から114	細胞培養
マトリゲル	コーニング	356237	CDX接種
FACS分析
デオキシリボヌクレアーゼI(ウシ膵臓由来)	シグマ	DN25	サンプル調製
コラゲナーゼI型	シグマ	C0130	サンプル調製
抗マウス/ヒトCD11b(M1/70)抗体	バイオレジェンド	101206	FACSの
抗マウスLy-6C(HK1.4)抗体	バイオレジェンド	128008	FACSの
抗マウスLy-6G(1A8)抗体	バイオレジェンド	127614	FACSの
抗ヒトCD8(OKT8)抗体	サンジーン・バイオテック	H10082-11H-J	FACSの
抗ヒトCD279(MIH4)抗体	eバイオサイエンス	12-9969-42	FACSの
抗ヒトCD3(HIT3a)抗体	4Aバイオテクノロジー	--	FACSの
Guava easyCyte 8HT ベンチトップフローサイトメーター	ミリポア	〒0500-4008	FACSの
腫瘍/PDX移植/投薬/測定
シクロホスファミド	J&K	カタログ番号#419656、CAS#6055-19-2	in vivoでの効能
ジスルフィラム	J&K	カタログ番号#591123、CAS#97-77-8	in vivoでの効能
注射器	BDの	300841	CDX接種
皮下注射針(14G)	上海SAメディシオール&プラスチックインスツルメンツ株式会社	0.7 * 32 TW SB	PDX接種
ノギス(MarCal)	マール	16ERシリーズ	腫瘍測定
IVC個別換気ケージ	Lingyunboji株式会社	IVC-128	動物施設

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