siRNAによる単純ヘルペスウイルス感染未成熟樹状細胞におけるオートファジーの阻害

要約

出典:Düthorn, A., et al. 単純ヘルペスウイルス1型感染単球由来樹状細胞におけるオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 。

このビデオでは、オートファジーフラックスを妨害するsmall interfering RNA(siRNA)ベースの手法を実演しています。FIP200 mRNAを標的とするsiRNAをエレクトロポレーションを用いて単球由来未成熟樹状細胞(iDC)に導入すると、FIP200の発現がノックダウンされ、オートファジーを介して核ラミン破壊が阻害されます。単純ヘルペスウイルス(HSV)を添加すると、オートファジーフラックスによるラミン破壊がないため、ウイルス子孫の核脱出が阻害されます。

プロトコル

単球由来DCは、健康なドナーの白血球アフェレーシス産物から生成されました。このため、地元の倫理委員会から賛成票が集まりました(参照番号4556)。本研究の実験は、「フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテート・エアランゲン・ニュルンベルク」(参照番号4556)の倫理委員会の勧告に従って実施されました。全てのドナーは、ヘルシンキ宣言の遵守を含む書面によるインフォームド・コンセントを承認した。

1. 未成熟樹状細胞(iDC)および成熟樹状細胞(mDC)の生成と取り扱い

1. 前述のように、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を白血還元システムチャンバー(LRSC)から単離します。PBMCの凍結保存は避け、単離後に直接使用すると、DC収率が向上します。
2. 前述のように、T175細胞培養フラスコ内のさまざまな健康なドナーのPBMCからヒトDCを生成します。簡単に言うと、30 mLのDC培地(RPMI 1640、L-グルタミンなし、1%(v / v)ヒト血清AB型(AB-血清)、100 U / mLペニシリン、100 mg / mLストレプトマイシン、0.4 mM L-グルタミン、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES))に350〜4億のPBMCを使用して、接着による単球の単離を行います。1時間後、RPMI 1640を使用して非接着画分を洗い流します。800 U/mL顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)および250 U/mLインターロイキン-4(IL-4)を添加した新鮮なDC培地を加え、3日間インキュベートします。
   1. 接着後3日目に、GM-CSFおよびIL-4を含む新鮮なDC培地5 mLを、最終濃度が細胞培養フラスコあたりそれぞれ400 U/mLおよび250 U/mLで、DC分化のために添加します。
   2. iDCを回収するには、接着後4日目に、細胞培養フラスコの底から緩く付着したiDCを静かにすすいでください。この手順を 2 回繰り返します。mDCの生成には、GM-CSF(最終濃度:40 U/mL)、IL-4(最終濃度:250 U/mL)、インターロイキン-6(IL-6、最終濃度:1000 U/mL)、インターロイキン-1ベータ(IL-1β、最終濃度:200 U/mL)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α、最終濃度:10 ng/mL)、プロスタグランジンE2(PGE2;最終濃度:1 μg/mL)を添加します。
   3. 接着後6日後(サイトカインカクテルを用いた成熟誘導後2日)に、細胞培養フラスコの底からmDCをすすぎます。この手順を 2 回繰り返します。
      手記：未成熟DCおよび成熟DCは、1細胞培養フラスコ内の同一ドナーから逐次的に生成できます。これを行うには、(i)適切な数のiDCを分離し、(ii)ステップ1.2.2にリストされているサイトカインカクテルを使用してフラスコ内の残りの細胞の成熟を誘導します。
3. それぞれの細胞培養培地中のiDCまたはmDCを50 mLチューブに移します。300 x gで5分間遠心分離することにより、細胞を回収します。
   1. 細胞培養フラスコあたり5〜10 mLのRPMI 1640にDCを穏やかに再懸濁(=洗浄)します。それぞれのDCサスペンションを1つのチューブに組み合わせます。
   2. カウントチャンバーまたは別の方法を使用してセル番号を定義します。iDCを取り扱う際には温度変化を避け、表現型の変化のリスクを軽減します。

2. 表現型の成熟状態をモニタリングするためのフローサイトメトリー解析

1. ステップ 1.3.1 の iDC または mDC(0.5 x 10⁶)を 1.5 mL チューブに移します。3390 x gで1.5分間遠心分離することにより、細胞を回収します。細胞をFACSバッファー(PBSに2%ウシ胎児血清(FCS)を添加)で一度洗浄します。
2. 特定の表面分子に対する特異的蛍光色素標識抗体を含む抗体染色溶液(FACSバッファー)100 μLに細胞を再懸濁します。
   1. 以下の抗体を使用して、DCの純度(CD3-フルオレセインイソチオシアネート[FITC]、CD14-フィコエリトリン[PE])および成熟状態(CD80-PacBlue [Pacific Blue]/-PE- シアニン5 [Cy5]、CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、CD86-PE、MHCII-APC-Cy7)の成熟状態を確認します。
   2. コントロールとして、100 μLのFACSバッファーに未染色のサンプルを1つ調製します。
   3. 細胞を氷上で暗闇で30分間染色します。
3. 続いて、細胞を1mLのFACSバッファーで2回洗浄し、3390×gで1.5分間遠心分離します。
4. 最後に、2%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加した200 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーで細胞を分析します。固定細胞は、暗所で4°Cで最大2日間保存できます。

>3. FIP200-siRNAを用いたiDCのエレクトロポレーションによるHSV-1誘導オートファジーフラックスの干渉

>注:siRNAエレクトロポレーションの現在のプロトコルは、Prechtel et al. (2007) および Gerer et al. (2017) から変更されました。

1. アドヒアランス後3.5日目にiDC(12 x 10⁶)を50 mLチューブに移します。続いて、細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。並行して、ステップ2(CD80-PacBlueの代わりにLife/Dead violetを使用)で説明したように、フローサイトメトリー解析を実施して成熟状態をモニタリングします。
2. フェノールレッドを含まないOptiMEMの5 mLでiDCを穏やかに洗浄し、細胞を300 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、フェノールレッドを含まないOptiMEMの200 μLにiDCを穏やかに再懸濁し、細胞濃度を6 x 10⁶/100 μLに調整します。セルを氷の上に置かず、温度変化を避けてください。迅速に行動し、フェノールレッドを含まないOptiMEMでのiDCの長いインキュベーション期間を避けてください。
3. 75 pmol の FIP200 特異的 siRNA または 75 pmol のスクランブル siRNA をコントロールとして 4 mm 電気キュベットに移し、100 μL (6x10⁶ 細胞) の細胞懸濁液を添加します。エレクトロポレーション装置Iを使用してiDCを直接パルスし、次の設定を適用します:500Vで1ms。
   1. 実験手順に先立ち、製造元の指示に従ってsiRNA懸濁液を調製し、-20°Cで分注して保存します。これらのsiRNAをエレクトロポレーションに使用する場合は解凍し、氷上に保ちます。サンプルをエレクトロポレーションする前に、テストパルスを実行してください。
4. エレクトロポレーション後、温めた新鮮なDC培地(40 U/mLのGM-CSFと250 U/mLのIL-4を添加)を使用して、iDCを6ウェルプレートに直接移します。最終濃度1 x 10⁶/mLで細胞を播種し、インキュベーターに入れます。セルを電気キュベットから洗い流さないでください。
5. 48時間後、まずエレクトロポレーションされたiDCの形態を顕微鏡で調べます。次に、セルスクレーパーを使用して細胞を回収し、15mLのチューブに移します。0.01%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加したPBS1 mLでウェルをすすぎ、溶液をそれぞれのチューブに移します。
6. その後、次のステップで説明するように、siRNA条件ごとに6 x 10⁶ iDCを分割します。
   1. 0.5 x 10⁶細胞を使用して、ステップ2で説明したように、成熟状態と細胞生存率を評価します。次の抗体を使用してください:CD11c-PE-Cy5、CCR7-PE-Cy7、CD83-APC、MHCII-APC-Cy7、およびLife/Dead violet。
   2. ウェスタンブロット分析に1 x 10⁶セルを使用して、FIP200特異的なノックダウン効率を検証します。細胞を1.5 mLのセーフロックチューブに移し、3390 x gで1.5分間遠心分離して回収します。細胞ライセートを調製し、ウェスタンブロット解析を行います。
   3. 残りの細胞(4.5 x 10⁶)をHSV-1感染実験に使用します。各実験条件について、2.25 x 10⁶ iDC を 2 mL チューブに移し、感染多重度(MOI)が 2 で HSV1 に感染させるか、模擬コントロールとして MNT バッファーを追加します。説明に従って感染を実行します。
   4. 感染後20時間後(hpi)に、セルスクレーパーを使用して細胞を回収し、ウェスタンブロット分析用の細胞ライセートを調製します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4D-Nucleofector Core Unit(エレクトロポレーション装置II)	ロンザ(スイス、バーゼル)	AAF-1002Bの
AB-セラム	Sigma Aldrich Chemie GmbH (ドイツ、シュタインハイム)	H4522-J	樹状細胞の培養
ACD-Aの	Sigma-Aldrich Chemie GmbH(ドイツ、シュタインハイム)	9007281
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (エレクトロポレーションキット装置II)	ロンザ(スイス、バーゼル)	V4XP-3024
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection 試薬	GE Healthcare(ドイツ・ゾーリンゲン)	RPN2232	ウェスタンブロット検出
過硫酸アンモニウム(APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (ドイツ、シュタインハイム)	A3678の
抗マウスIgG(マウス、ポリクローナル、HRP)	Cell Signaling(オランダ、ライデン)	7076	ウェスタンブロット検出
抗ウサギIgG(ヤギ、ポリクローナル、HRP)	Cell Signaling(オランダ、ライデン)	7074	ウェスタンブロット検出
BD FACS Canto II フローサイトメーター	BD Biosciences(ドイツ・ハイデルベルク)	338962
ブロッティングチャンバーFastblot B44	Biometra (ゲッティンゲン、ドイツ)	〒846-015-100
CCR7(マウス、Pe-Cy7)	BioLegend(ドイツ、フェル)	557648	フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:G043H7
CD11c(マウス、Pe-Cy5)	BD Biosciences(ドイツ・ハイデルベルク)	561692	フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:B-ly6
CD14 (マウス、PE)	BD Biosciences(ドイツ・ハイデルベルク)	555398	フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:M5E2
CD3 (マウス、FITC)	BD Biosciences(ドイツ・ハイデルベルク)	555332	フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:UCHT1
CD80 (マウス、V450)	BD Biosciences(ドイツ・ハイデルベルク)	560442	フローサイトメトリー 希釈率:1:100 クローン:L307.4
CD83 (マウス、APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific(ドイツ、ランゲンゼルボルド)	〒17-0839-41	フローサイトメトリー 希釈率:1:200 クローン:HB15e
CD86 (マウス、PE)	BD Biosciences(ドイツ・ハイデルベルク)	553692	フローサイトメトリー 希釈:1:100
EVOS FL細胞イメージング	System AMG/Life Technologies(アメリカ・カールスバッド)	AMF4300
FIP200(ウサギ)	Cell Signaling(オランダ、ライデン)	12436	ウェスタンブロット検出 希釈:1:1000 クローン:D10D11
Gene Pulser II装置(エレクトロポレーション装置I)	BioRad Laboratories GmbH (ドイツ、ミュンヘン)	〒165-2112
GM-CSF(4x104 U/mL)	Miltenyi Biotec(ドイツ・ベルギッシュ・グラートバッハ)	〒130-093-868
HLA-DR(マウス、APC-Cy7)	BioLegend(ドイツ、フェル)	307618	フローサイトメトリー 希釈率:1:200 クローン:L243
HSV-1 / 17 + / CMV-EGFP / UL43	バイオベックス		DC感染
IL-1β (0.1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH(ドイツ、フライブルク)	1411-050
IL-4 (1x106 U/mL)	Miltenyi Biotec(ドイツ・ベルギッシュ・グラートバッハ)	〒130-093-924
IL-6 (1x106 U/mL)	Cell Genix GmbH(ドイツ、フライブルク)	1404-050
ImageQuant LAS 4000 (英語	GE Healthcare(ドイツ・ゾーリンゲン)	28955810
L-グルタミン	ロンザ(スイス、バーゼル)	17-605E
LIVE/DEAD フィックスタブル バイオレット デッドセルステインキット	Life Technologies(米国カリフォルニア州カールスバッド)	L34964	フローサイトメトリーにおけるL/D染色
リンポプレップ	Alere Technologies AS(ノルウェー・オスロ)	04-03-9391/01
塩化マグネシウム	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	A537.1 (英語
メガフージ2.0 RS	ヘレウス社(ドイツ・ハーナウ州)	75015505
ノイバウアー計数室	ブランド(ヴェルトハイム、ドイツ)	717805
Nunc細胞培養フラスコ(175.0 cm2)	Thermo Scientific(米国ロックフォード)	159910
パラホルムアルデヒド、16 %	Alfa Aesar, Haverhill, アメリカ	43368.9M 閲覧数
パーフェクトスピン 24 プラス	Peqlab(ドイツ、エアランゲン)	C2500-R-PL
PGE2 (1 mg/mL)	ファイザー社(ドイツ・ベルリン)	BE130681
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ロンザ(スイス、バーゼル)	17-512階
RestoreTM ウェスタンブロットストリッピングバッファー	Thermo Scientific、ロックフォード、米国	21059
ロッキングプラットフォーム wt 15	Biometra (ゲッティンゲン、ドイツ)	〒042-590
ロティブロック	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	A151.4 (日本語)
ロティロード1(4倍)	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	K929.3
ロチフォアゲル30(37.5:1)	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	3029.1
RPMIの1640	ロンザ(スイス、バーゼル)	12-167階
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	2326.2
サーモミキサーの快適性	エッペンドルフ(ドイツ、ハンブルク)	5355 000.011
TNF-α(10μg/mL)	Peprotech(ドイツ・ハンブルク)	300-01A
トリス	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	4855.3
トリパンブルー溶液(0.4%)	Sigma-Aldrich Chemie GmbH(ドイツ、シュタインハイム)	T8154
トゥイーン 20	Carl Roth GmbH (カールスルーエ、ドイツ)	9127.1
Whatman 0.2 μm ニトロセルロースメンブレン	GE Healthcare(ドイツ・ゾーリンゲン)	10600001
WhatmanTM クロマトグラフィーペーパー 3 mm Chr	Fisher Scientific GmbH (ドイツ、シュヴェルテ)	3030917

名 名 ) ) シリーズ