マウスモデルにおける細菌免疫調節タンパク質の抗腫瘍効果の評価

要約

出典:Codolo, G. et al. 同所性マウスモデルにおける膀胱がん治療のための治療ツールとしてのピロリ菌タンパク質HP-NAPの有効性の評価。J. Vis. Exp. (2015年度)

このビデオは、マウスの膀胱がんモデルにおけるヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質(HP-NAP)の抗腫瘍活性を評価する技術を示しています。HP-NAPは腫瘍細胞好中球と相互作用して炎症誘発性サイトカインを産生し、ナイーブT細胞を1型ヘルパーT細胞(Th1)および1型細胞傷害性T細胞(Tc1)T細胞表現型に分化させます。Th1細胞とTc1細胞はインターフェロンガンマを分泌し、腫瘍血管新生を阻害し、細胞傷害性T細胞媒介性腫瘍破壊を促進し、腫瘍体積を減少させます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 動物

1. C57BL6/J 雌マウスを、マイクロアイソレーションフィルター付きの個別換気ケージで 8 週齢まで増殖させます。
   注:女性は、外部泌尿生殖器の解剖学的コンフォメーションが男性よりもカテーテル挿入を容易にするため、好まれます。

2. 細胞培養

1. マウス尿路上皮がん細胞株MB49を、10%熱不活化ウシ胎児血清と50μg/mlゲンタマイシンを添加したRPMI 1640培地で、加湿した5%二酸化炭素(CO₂)に37°Cで維持します。
2. T-75フラスコ中のMB49細胞を80%コンフルエンスまで増殖させます。マウスに移植する前に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)150μlあたり0.5 ×^{10 5} - 0.5 × 10⁶細胞でトリプシンを添加し、再懸濁します。

3. 膀胱内腫瘍インプラント

1. 麻酔薬ゾレチルとキシラー(それぞれ33 mg / kgおよび20 mg / kg)の混合物を使用してマウスに麻酔をかけ、腹腔内に注射します。
2. 動物を仰臥位に置き、後ろ足をスコッチテープでパッドに固定します。足は、尿道口がよく見え、カテーテル挿入のために簡単にアクセスできるように、十分に分離されている必要があります。
3. 注:カテーテル挿入には、24 Gの小児静脈カテーテルが8〜10週齢のマウスに適しています。尿道壁とカテーテルの間の液体漏れを避けるために、カテーテルの選択は重要です。より大きな口径のカテーテルは、より大きなマウスまたは古いマウスに使用する必要があります。
4. 小さなニッパーを使用して、尿道の外側部分の一方の端をつまみ、マウスの「頭の端」に向かって非常に穏やかにねじります。この作用により、尿道口が露出します。
5. カテーテルの内部針を取り外し、カテーテルを尿道に45°の角度で挿入し、マウスの「尾端」にわずかに向けます。カテーテルを無理に挿入しないでください。抵抗がある場合は、カテーテルが尿道の中に入るまで非常に穏やかにひねります。尿道に0.5〜0.8cm程度のカテーテルが入ったら、マウスの尾と平行にカテーテルを慎重に置き、完全に挿入します。
6. 針をカテーテルに挿入する必要がある1mlの注射器を使用して、200〜300μlの滅菌PBSを注入して膀胱を残留尿から洗浄し、膀胱からすべての液体を吸引します。
7. 注:PBSを注入すると、膀胱がいっぱいになり、マウスの後肢の間に腫れが見えます;これにより、カテーテル法が正しいことが確認されます。ほとんどのカテーテルにはデッドボリュームがあり、注入量を計算する際に考慮する必要があります。
8. 滅菌済みの1 mLシリンジを使用して、0.1 N塩酸(HCl)200 μlを注入します。膀胱を満たして壁全体を燃やします。10秒後、すべての酸を取り除き、滅菌シリンジで0.1N水酸化ナトリウム(NaOH)200μlを注入して直ちに中和します。最大数の細胞(0.5 × 10⁶)を注入する場合、酸性化ステップは必要ありません。
9. すべての残留液体を吸引し、すぐに300 μlの滅菌PBSでキャビティを洗い流します。
10. 吸引して膀胱を空にし、MB49細胞を含むPBS150μl(範囲0.5×10⁵ - 0.5 × 10⁶)を膀胱に注入します。細胞の漏れを防ぐために、組み立てたシリンジをカテーテルに残しておきます。シリンジはスコッチテープでパッドに固定して固定するのが良いです。
11. 1時間後、尿道からカテーテルを静かに抜き取り、マウスを白熱灯の下のケージに入れます:これは通常、治療終了後1〜2時間後に発生します。

>4. ヘリコバクター・ピロリ好中球活性化タンパク質(HP-NAP)の膀胱内送達

1. 注:細胞点眼の少なくとも3日後、治療を開始することが可能です。
2. 手順3.1から3.4の説明に従ってカテーテルを挿入します。この段階では、HClで膀胱壁を燃やす必要はありません。
3. 1mlのシリンジを使用して、200〜300μlの滅菌PBSを注入して残留尿から膀胱を洗い、膀胱からすべての液体を吸引します。
4. 150 μl PBSあたり50 μgのHP-NAPを膀胱に注入します。タンパク質溶液の漏れを防ぐために、シリンジをカテーテルに取り付けたままにしておきます。シリンジをスコッチテープでパッドに固定して固定します。
5. 1時間後、尿道からカテーテルを静かに抜き取り、マウスが目を覚ますまで白熱灯の下のケージに入れます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J 雌マウス	Harlan Italy (イタリア、ウーディネ)
MB49 セル			米国アイオワ州アイオワ大学カーバー医科大学のオドネル教授から取得
RPMI(ルプミ)	Sigma-Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)	R8758
FBSの	シグマ・アルドリッチ	F7524
PBSの	シグマ・アルドリッチ	D1408	10X、アパイロジェニック水で希釈します
フラスコ	ベクトン・ディキンソン(米国ニュージャージー州フランクリンレイクス)	353135
シリンジ 1ml	ベクトン・ディキンソン	301358
トリプシン	Life Technologies(米国マサチューセッツ州ウォルサム)
ゲンタマイシン	ライフテクノロジー	15710-049
Xilor (英語)	Bio 98 s.r.l. (イタリア、ミラノ)		2%キシラジン
ゾレチル	Virbac(フランス、カロス)	3.59713E+11	5%ゾラゼパム+ 5%チレタミン
24Gカテーテル	テルモ(イタリア・ローマ)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba試薬(イタリア、ミラノ)	403871	液体
NaOH	JTベイカー(米国ペンシルベニア州センターバレー)	10095011	粉

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