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動物モデルを含むすべての手順は、local
によってレビューされています。
施設の動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会。サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. iPS細胞からのウイルス性Ag特異的CD8+ T細胞の生成 (iPSC-CD8+ T細胞)
- レトロウイルスコンストラクトの創製
手記：T細胞受容体(TCR)α遺伝子とβ遺伝子は、2A自己切断配列と関連しています。レトロウイルスベクターMSCV-IRES-DsRed(MiDR)はDsRed+です。
- HBs183-191(FLLTRILTI)特異的なA2制限ヒト-マウスハイブリッドTCR(s183 TCR)遺伝子(Vα34およびVβ28)をMiDRにサブクローンして、s183 MiDRコンストラクトを作成します(図1A)。
- レトロウイルス形質導入
注:Platinum-E(Plat-E)細胞は、レトロウイルス形質導入に使用されるレトロウイルス(s183 TCR遺伝子を保有)のパッケージングに使用されます。Plat-E細胞は、293T細胞の基礎となる有効なレトロウイルスパッケージング細胞であり、EF1αプロモーターを介した独自のパッケージングコンストラクトによって開発された、gag、pol、ecotropic envなどのレトロウイルス構造タンパク質を発現します。
- 100 mm培養皿に、トランスフェクションの1日前に、10%ウシ胎児血清(FCS)を含む8 mLのDMEM培養培地に3 x 106 Plat-E細胞を播種し、インキュベーター(37 °C、5% CO2)でトランスフェクションします。
- 0日目に、DNAトランスフェクション試薬を使用して、s183 MiDRコンストラクトをPlat-E細胞にトランスフェクションします。
- 1日目に、1 x 106 iPSC(緑色蛍光タンパク質[GFP]+)をゼラチンプレコート培養プレートに播種します。
- 2日目から3日目に、Plat-E細胞培養物からレトロウイルス含有上清を採取し、1,6-ジブロモヘキサン溶液の存在下でs183 TCRでiPS細胞を形質導入します。
- 4日目に、s183 TCR遺伝子導入iPS細胞をトリプシン処理し、400 x gで5分間遠心分離し、3 x 106を照射したSNL76/7(irSNL76/7)フィーダー細胞でプレコートした100 mm培養皿に3 × 105 iPS細胞を播種します。
- コンフルエンスの5日目または6日目に、細胞をトリプシン処理し、400 x gで5分間遠心分離し、細胞選別のためのプロセスを行います。生細胞をゲーティングし、高速セルソーターを使用してGFPおよびDsREDのダブルポジティブ細胞(s183 TCR遺伝子形質導入iPS細胞)をソーティングします。ステップ1.2.5と同様に、選別した細胞をirSNL76/7フィーダー細胞で共培養し、将来の使用に備えます。
- HBV特異的iPSC-CD8+ T細胞の分化
注:OP9-DL1/DL4間質細胞は、NotchリガンドDL1およびDL4の両方を過剰発現し、iPS細胞をiPS細胞と共培養することで、Notchシグナル伝達を介したT細胞の分化を促進することができます。
- 20%のウシ胎児血清(FBS)を含むα最小必須培地(MEM)培地中のOP9-DL1-DL4細胞単層で、s183 TCR遺伝子導入iPS細胞(s183/iPSC)を増殖させます。マウスFMS様チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド(mFlt-3L;最終濃度=5 ng/mL)を培養物に含めます。
- 0日目に、OP9-DL1-DL4細胞で以前に増殖させた10 cmの培養皿に0.5–1.0 x 105 S183/iPS細胞を播種します。OP9-DL1-DL4細胞が80%〜90%のコンフルエントな状態にあることを確認します。
- 5日目に、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でiPS細胞をすすぎ、PBSを吸引し、これを4 mLの0.25%トリプシンに加え、37 °Cインキュベーターで10分間インキュベートします。細胞を含むすべての消化液を蓄積し、400 x gで15〜30°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、細胞を10 mLのiPSC培地に再懸濁します。細胞懸濁液を新しい10 cmペトリプレートに移し、インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
- 30分後、浮遊細胞を含むiPSC培地を回収します。細胞懸濁液を70μmのセルストレーナーに通し、セル数を計算します。
- ステップ1.3.1.
で説明されているように、80%〜90%のコンフルエントな条件で以前に増殖させたOP9-DL1-DL4細胞を培養皿に5 x 105細胞を播種します
手記：T細胞の分化のためには、2〜3日ごとに、iPS細胞由来細胞にOP9-DL1-DL4細胞の新しい層を再播種する必要があります。
- 評価
- 分化型iPS細胞の形態変化
- 様々な日に顕微鏡で細胞を観察する.
手記：5日目までに、コロニーは中胚葉のような特徴を持ち、ヒトの真皮線維芽細胞に似た古典的な紡錘形の形態を示し、in vitroで持続的に成長します。8日目までに、細胞の小さな丸いクラスターが現れ始めます。
- フローサイトメトリーによる分化性iPS細胞の解析
- 共培養の様々な日に、前述のようにiPS細胞由来細胞を解析します(図1B、C)。
- 分化型iPS細胞の機能解析
- 共培養の28日目に、浮遊細胞を回収して培養物からiPSC-CD8+ T細胞を採取し、残った細胞を0.25%トリプシンでトリプシン化し、8mLのiPS細胞培地に再懸濁し、15〜30°Cで400 x gで5分間遠心分離し、培地を取り出してから、細胞を10mLの培地に再懸濁します。
- 再懸濁した細胞を新鮮な10 cm皿に入れ、37°Cのインキュベーターで30分間保管し、浮遊細胞を組み立てます。次に、冷たいPBSで細胞を1回すすぎます。
- H-2クラスIノックアウトHLA-A2.1トランスジェニック(HHD)マウスの脾臓由来の3 x 106 T細胞枯渇脾臓細胞(CD4-CD8-)と5 μM s183ペプチド(FLLTRILTI)を200 μL培地中で4°C、30分間インキュベー
トします。
- iPSC-CD8+ T細胞とs183ペプチドをパルスした脾細胞との混合物を作製します(T細胞:脾細胞= 1:4;0.75 x 106 T細胞を使用)。細胞の混合物を37°CでCO2インキュベーターで40時間インキュベートします。最後の7時間の間に、希釈したブレフェルジンAを4 μLを培養物に加え(最終濃度1,000倍、1倍培地で希釈します)、細胞活性化中の輸送プロセスをブロックします。
- 細胞を染色し、前述のように細胞内インターフェロンガンマ(IFN-γ)のフローサイトメトリー解析を行います(図2)。
2. HBVプラスミドの流体力学的送達によるHBV複製の誘導
>注: pAAV/HBV1.2 コンストラクトは、前述のように生成されました。HBV 1.2 完全 DNA はベクター pAAV に組み込まれています。
- 尾静脈を介したHBVプラスミドの流体力学的送達
- HHDマウスをケージ内でヒートランプを使用して5分間加熱し、尾静脈を拡張します。
- 拘束具を使用して動物を拘束し、70%エタノールスプレーでマウスの尾をきれいにします。
- 肝臓へのプラスミドの送達。
- 測定スケールを使用してマウスの体重を測定します。
- 10 μgのHBVプラスミドを、体重PBSの8%相当量(例:20 gマウスの場合は1.6 mL)に希釈します。26 G × 1⁄2インチ(0.45 × 12 mm)皮下注射針を備えた3 mLシリンジで希釈したプラスミドをロードします。
- 尾の中央3分の1にある2つの側尾静脈のうちの1つを見つけ、針をいずれかの側静脈に配置します。HBVプラスミドを含む注射液を尾静脈から3〜5秒以内に投与します。
- 感染マウスの血清からのウイルス血症の定量
手記：HBVの複製は、マウス血清中で3日目から35日目にかけて起こります。DNA複製は7日目にピークに達し、徐々に減少します。HBV DNAは35日目まで血清から除去されません。
- 感染マウスからの血清採取
- 感染後3、5、7、および10日に、1.5 mLのマイクロ遠心チューブで眼窩後出血により、各マウスからマイクロ遠心チューブに約0.1 mLの血液を採取し、室温(RT)で20分間インキュベートします。
- サンプルを6,000 x gで4°Cで15分間遠心分離し、遠心分離後に血清上清を回収します。
- メーカーの推奨に従って、市販のDNA抽出キットを使用して血清からDNAを精製します。簡単に説明すると、シリカベースのカラムで細胞を溶解し、洗浄を行い、溶出カラムに100%エタノールを添加し、6000 x gで1分間遠心分離することによりDNAを抽出します。50 μL の RNase フリー水で DNA を溶出します。
- 溶出液から採取したHBV DNA100 ngをリアルタイムPCR解析に使用してください。次のプライマーとプローブを使用してください: 前方 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3';逆 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3';プローブ 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- HBVゲノムを含むプラスミド(pAAV/HBV1.2)を標準曲線に用い、総容量10 μLでリアルタイムPCRを実施します(図3)。
- 表1に示すように、PCR反応液を総容量10 μLでセットアップします。
- サーモサイクラーでPCRプログラムをセットアップします(表2を参照)。プログラムされた温度転移速度は、変性/アニーリングで20°C/s、伸長で5°C/sです。アニーリングフェーズの終了時の蛍光を各サイクルで測定し、リアルタイムPCRモニタリングを行います。
3. ウイルス性Ag特異的iPSC-CD8+ T細胞のACTによるHBV複製の減少
- 養子細胞移植(ACT)
- セクション1.3で説明したように、mFlt-3LおよびmIL-7の存在下でOP9-DL1-DL4間質細胞上のs183/iPSC(1.3.7)を分化します。
- 22日目に、トリプシンを含む10 cmプレートからiPSC-CD8+ T細胞を採取し、各10 cmプレートを10 mLの新鮮な培地で洗浄して再懸濁します。細胞を新鮮な10cmプレートに加え、セクション1.3で行ったように、インキュベーターに30分間戻します。30分後、浮遊セルを収集します。
- 70 μmのナイロンストレーナを使用して細胞を通過させ、細胞クラスターを排除し、細胞数をカウントします。冷PBS溶液中で細胞を1.5 x 107細胞/mLの濃度に適合させ、必要に応じて70 μmのナイロンストレーナーを使用して細胞を通過させ、細胞クラスターを再度除去します。ACTまで細胞を氷上に保ちます。
- 200 μLの細胞懸濁液(3 x 106細胞)を4〜6週齢のHHDマウスに尾静脈から注入します。
- HBVレプリケーションの誘導
- 細胞移入後14日目に、セクション2.1に記載されているように、尾静脈を介してHBVプラスミドの流体力学的導入を行います。
>表1:PCR反応量
| DNAテンプレート | 2ミリリットル |
| DNAマスターハイブリダイゼーション混合物(Taq DNAポリメラーゼ、PCR反応バッファー、10 mM MgCl2、およびdNTP混合物) | 1ミリリットル |
| 25 mM MgCl2 | 0.8ミリリットル |
| 0.3 μM プローブ | 3ミリリットル |
| 各プライマーの5 μM | 3.2ミリリットル |
| トータル | 10ミリリットル |
>表2:PCRプログラム
| 変性 | 温度
95°C | 時間
5秒 |
| アニーリング | 53°C | 10秒 |
| 延長 | 72°C | 20秒 |
| 5°C | |
