マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の細胞ベース療法

要約

出典:Haque, M. et al., 自己免疫に対する幹細胞由来抗原特異的制御性T細胞の開発.J. Vis. Exp. (2016年度)

このビデオは、マウスの自己免疫性関節炎に対する細胞ベースの治療法を紹介しています。オボアルブミン特異的受容体を発現するiPS細胞由来T制御細胞に、アジュバントで乳化したメチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)を注入します。マウス抗原提示細胞(APC)は、mBSAを処理してT細胞に提示し、T細胞の活性化と膝関節の滑膜への移動を促進します。その後の注射では、左膝にmBSAのみを使用し、右膝にmBSAとオボアルブミンの組み合わせを投与します。左膝では、mBSAに対する免疫応答が関節炎を引き起こし、右膝では、オボアルブミンと相互作用するT制御細胞が炎症を軽減し、関節炎の症状を改善します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 自己免疫性関節炎の生体内成熟と抑制

1. OT-II T細胞受容体(TCR)遺伝子とフォークヘッドボックスタンパク質3(FoxP3)を自己切断ペプチド2Aに結合したMiDRプラスミドにサブクローニングしてMiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3コンストラクトを作製することにより、レトロウイルス形質導入に使用するコンストラクトを作製します。
2. Plat E細胞をパッケージング細胞株として、人工多能性幹細胞(iPSC)のレトロウイルス形質導入を行います。
3. マウスにおけるin vivo分化と関節炎誘発。
   1. サイトカインmFlt-3LおよびmIL-7の存在下で、OP9-DL1-DL4-I-A^b間質細胞上のOT-II TCR/FoxP3形質導入iPSC(OT-II-FoxP3/iPSC)、FoxP3形質導入iPSC、およびDsRed形質導入iPS細胞を鑑別します。
   2. 0日目に、OP-9培地(20%のウシ胎児血清(FCS)と2.2g / L重炭酸ナトリウムを含むα-MEM培地)を使用して、最小密度10⁴細胞/^cm2でOP9-DL1-DL4-I-A^b細胞を播種します。プレート1 x 10 10cm皿あたり⁶セル。
   3. 3日目に、OP9-DL1-DL4-I-A^b細胞が80-90%コンフルエントになったら、培地を取り出し、OP-9培地中のOP9-DL1-DL4--I-A^b細胞の上に0.5 - 1 x 10⁵ iPS細胞を播種します
      注:これにより、OP9-DL1-DL4-I-A^b細胞上でiPS細胞の共培養が確立され、分化の0日目と見なされます。
   4. 5日目に、10cm皿から培地を吸引して取り出し、細胞を10mlの1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、PBSを吸引します。0.25%トリプシン4 mLを加え、37°Cで10分間インキュベートします。さらに8 mLのiPS細胞培地を細胞に加え、再度懸濁し、400 x gで室温で5分間遠心分離します。
      1. 上清を吸引し、細胞を10 mLのiPS細胞培地に再懸濁します。これらの再懸濁細胞を新鮮な10 cm皿でインキュベートし、インキュベーターに30分間戻します
         注意: OP9-DL1-DL4-I-A^b フィーダーセルを取り外し、分化している iPSC をメディアに保持します。OP9-DL1-DL4-I-A^b細胞を連続的に維持して、さらなる共培養のために80〜90%のコンフルエンシーを達成します。
      2. 30分後、浮遊細胞を採取し、70μmのセルストレーナーでろ過し、血球計算盤でカウントします。
   5. iPS細胞の5 x 10⁵を、OP9培地中のOP9-DL1-DL4-I-A^b細胞の新鮮な80 - 90%コンフルエントに播種します。mFlt-3Lを最終濃度5 ng/mLで培地に添加します。
   6. 10 cmプレートから3種類の細胞すべてをトリプシン処理し、各10 cmプレートの細胞を10 mLの新鮮な培地に再懸濁します。細胞を新鮮な10cmプレートに加え、インキュベーターに30分間戻します。30分後、浮遊セルを収集します。
   7. 70 μmのセルストレーナーに細胞を通し、細胞クラスターを除去し、血球計算盤を使用してカウントします。冷たくなったPBSで細胞を1.5 x 10⁷細胞/mlの濃度に調整し、必要に応じて再度ろ過します。養子細胞がマウスに移行するまで、細胞を氷上に置いておきます。
   8. 200 μlの細胞懸濁液 (3 x 10⁶細胞) を、4 - 6週齢の雌C57BL/6マウスの3つの異なるグループに尾静脈から注入します。
   9. 10日目に、細胞移植後、フロイントの完全アジュバントで乳化した100μgのメチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)を1mlのシリンジを使用して
   マウスに注入します。
   10. 17日目に、イソフルラン気化器を使用してマウスに麻酔をかけます。誘導のために4 - 5%のイソフルランおよび維持のための1 - 2%を利用しなさい。左膝関節の 10 μl PBS に 20 μg mBSA を、右膝関節の 10 μl PBS に 20 μg mBSA と 100 μg の全オボアルブミン (OVA) を関節内注射して関節炎を誘発します。関節炎が発症した後、食事とジェルパックを寝床に置くことができます。マウスは安楽死させます。体調スコア (BCS) が 2/5 または瀕死の状態、重度の悪液質および/または持続的な横臥 (24 時間の期間)、重症度スコア 4 です。スコア 4 では、紅斑と重度の腫れが足首を包み込みます。 足、指、または手足の強直筋。
4. OT-II TCR/FoxP3形質導入iPS細胞の特性評価。
   1. 蛍光顕微鏡(20倍)を使用して、未固定の生DsRed⁺ GFP⁺細胞を視覚化します。
   2. ウェスタンブロットとフローサイトメトリーの両方による遺伝子の統合と発現を調べます。
5. 関節炎抑制アッセイ
   1. 関節炎誘発前のマウスの両膝の腫れを、ダイヤルゲージキャリパーを使用してベースラインを確立することにより測定します。
   2. 関節炎の誘発とTreg移植の手順(1.3.1〜1.3.10)に従います。Tregトランスファー後のダイヤルゲージキャリパーでマウスの膝を測定します。
   3. 膝の直径の増加率を計算します: 増加率 = (1 日目の膝の直径 - 0 日目の膝の直径) / 0 日目の膝の直径。
6. 組織学による膝の関節破壊と炎症性細胞浸潤の測定(図1)。
   1. 関節炎誘発後の 7 日目に、二酸化炭素 (CO₂) 吸入とそれに続く頸部脱臼によりマウスを安楽死させます。電動クリッパーで膝の毛を取り除き、外科的処置で膝を切除します。
   2. 鈍い端のはさみで後ろ足を切開し、太ももを横切って足首まで皮膚を切開して、脚から皮膚を取り除きます。脚と足の上の皮膚をやさしく剥がして、筋肉を露出させます。膝関節を傷つけずに、脚から筋肉を慎重に取り外します。
      1. 骨盤/股関節のすぐ上の後ろ足を切り、鋭い解剖ハサミを使用して脛骨を切断します。
   3. 膝を4%ホルマリンで48時間固定します。2.5 Mギ酸を使用して膝を脱灰します。キシレンで3分間3回すすぎ、100%エタノールで2回すすぎ、95%エタノールで2回すすぎ、脱イオン水で2分間すすぎ、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で脱灰します。亜沸騰温度(90°C)で20分間処理します。
   4. 両膝を取り外し、10%ホルマリンで固定し、Formical-4で石灰化します。組織をパラフィンに埋め込み、4 μmで切片化し、ヘマトキシリンとエオシン(H & E)またはサフラニンO染色で染色し、顕微鏡で観察します。

結果

図1:Ag特異的iPSC-Tregsの養子導入はマウスのAIAを改善します。マウスiPS細胞は、レトロウイルスコンストラクトMiDR、MiDR-FoxP3、またはMiDR-TCR-FoxP3で形質導入し、OP9-DL1/DL4/I-A^b細胞で共培養しました。7日目に、遺伝子導入細胞(3 × 10⁶ /マウス)を、細胞移植の2週間後にAIAで誘導した雌C57BL / 6マウスに養子として移植しました。関節炎誘発の翌日、膝の直径の測定により関節炎の重症度を監視しました。(A-C)膝の直径の増加率。膝の直径の増加は、0 日目の注射前の各マウスの注射前の膝の直径に基づいて計算されました。関節炎スコアは、盲検化された方法で両膝を調べることによって評価されました。各膝にはスコアが割り当てられました...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6jマウス	ジャクソン研究所	664
α-MEM	インビトゲン	A10490-01
FBSの	ハイクロン	SH3007.01
ポリブレン	シグマ	107689
ジェネジャマー	統合科学	204130
mFlt-3L	ペプロテック	250〜31L
mIL-7	ペプロテック	217-17
mBSAの	シグマ	A7906
卵子アルブミン	アバンター	0440-01
CFAの	ディフコ	2017014
テールベイナー拘束	ブレインツリー科学	RTV 150-STDの
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148-500Gの	注意:アレルギー性、カルセノジェニック性、 毒性

名 さん の 具