腫瘍特異的キメラ抗原受容体T細胞を作製するためのex vivo技術

要約

出典:Riccione, K., et al. Generation of CAR T cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、腫瘍抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞のex vivo生成技術を示しています。トランスジェニックRNAを担持するレトロウイルスベクターは、インターロイキン-2を添加した培地で脾臓細胞と混合され、T細胞の生存と増殖を促進します。次に、混合物を組換えヒトフィブロネクチンフラグメントでコーティングしたプレートに移し、遠心分離してウイルスと細胞の融合を促進し、RNAを宿主ゲノムに統合し、腫瘍抗原を標的とする表面結合CARを産生できるようにします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 脾臓摘出術とT細胞の調製

0日目:

1. 10 mLのT細胞培地(TCM)を50 mLの円錐形に注ぎ、氷の上に置いて脾臓を採取します。
2. CO₂窒息と二次斬首によって適切な数の動物を犠牲にする:米国獣医師会のガイドラインに従って、CO₂を受け取るケージに動物を置きます(同時に犠牲にできる動物は5匹まで)呼吸が終了するまで、その後2分間。CO₂チャンバーから動物を取り出し、首を切る.
   手記：6〜12週齢の雌C57BL/6マウスの1つの脾臓は、約4.5〜5×10⁷個の脾細胞を生成します。ここでは、約200×10⁶細胞に対して4つの脾臓を採取します。
3. マウスの右側が上を向くようにマウスを置き、70%エタノールをスプレーします。鉗子で、左胸郭の下の皮膚の薄いひだをつかみ、はさみでわずかに切開します。皮膚をはがし、鉗子で腹膜の細いひだを慎重につかみ、小さな空洞を切ります。
4. 脾臓は、扁平になった豆に似た小さくて細長い暗赤色の器官で、鉗子で脾臓を繊細につかみ、周囲の結合組織を切り取って切除します。切除した脾臓を、氷上に10mlのTCMを含む円錐形に入れます。
5. 70 μmメッシュのセルストレーナーに脾臓を注ぎ、5 mLシリンジの内側の鈍い端でマッシュして脱凝集し、単一細胞懸濁液を生成します。メッシュストレーナごとに最大2つの脾臓を分解する必要があります。
6. 少量のTCMを使用して、分解後にストレーナーを慎重に洗浄し、残っている脾細胞を収集します。すべての細分化された脾臓を単一細胞懸濁液にプールします。TCMで最終容量を50 mLにして1回の洗浄で、300 x gで10分間遠心します。
7. 10x Lysis Bufferを5 mLの滅菌水に加え、1x Lysis Bufferの溶液を調製します。赤血球を除去するには、ペレットを50 mLの円錐形の脾臓あたり5 mLの1x溶解バッファーに再懸濁し、ピペッティングで穏やかに上下させてよく混合します。脾臓が5つを超える場合は、250mlの遠心チューブを使用してください。円錐形または遠心分離管を37°Cのウォーターバスに5分間入れます。
8. 水浴から溶解反応を取り除き、TCMを溶解バッファーと1:1の比率で添加して反応を中和します。300 x gで10分間回転させて洗浄します。
9. 上清を吸引し、ピペッティングで上下させてペレットをTCM(2 ml /脾臓、4つの脾臓の合計8 ml)に完全に再懸濁します。
10. 190 μlのトリパンブルー(1:20希釈)に10 μlの細胞懸濁液を加えて細胞をカウントします。4つの格子状の正方形のうちの1つで得られた数に20×10⁴×総体積(8ml)を掛けて、総細胞数(例えば、125細胞×20×10⁴×8ml=200×10⁶脾細胞)を求める。
11. TCMで細胞を2 x 10⁶細胞/mLの濃度に希釈し、2 μg/mlのコンカナバリンA(ConA)および50 IU/mlの組換えヒトインターロイキン-2(rhIL-2)を補充します。したがって、200 x 10⁶ 脾細胞の場合、92 mL 培地を 8 mL 細胞、200 μg ConA、および 5,000 IU rhIL-2 に添加します。
12. 24ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに2 mLの細胞を添加し、各ウェルに4 x 10⁶個の細胞が含まれるようにします(たとえば、100 mLの細胞には約4枚のプレートが必要です)。
13. 5% CO₂ で 37 °C で一晩インキュベートします。

2. 形質転換

1日目:

1. 形質導入に必要な非組織培養処理済み24ウェルプレートの数を、採取した脾臓の数に2を掛けて計算します(脾臓4枚に対して8枚のプレートが必要です)。
2. 次に、プレートのコーティングに必要な組換えヒトフィブロネクチンフラグメント(RHFF)溶液の必要量を、(ウェルの総数 + 3) x 0.5 ml(8 プレート x 24 ウェル = 192 + 3 = 195) x 0.5 ml = 97.5 ml を掛けて計算します。
3. RHFFを含む97.5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、総容量に25 μg/mlを乗じて25 μg/mlで調製します(97.5 x 25 = 2437.5 μg)。この量のRHFFを97.5mlPBSに加えます。
4. 非組織培養処理した24ウェルプレートを、ウェルあたり0.5 mLのPBS/RHFF溶液を添加してコーティングします。
5. 4°Cで一晩インキュベートします。

2日目:

6. PBS/RHFF溶液を非組織培養処理した24ウェルプレートからダンプします。
7. 1 mL/ウェルの2%ウシ血清アルブミン(BSA)をPBSに添加し、室温で30分間インキュベートします。
8. プレートをしっかりとひっくり返してBSAを取り外します。2mlのPBSを加えて洗ってください。
9. 各ヒト胚性腎臓293T(HEK293T)-ポリ-D-リジン(PDL)コーティングプレートから培地を250 mLの遠心チューブに移し、500 x gで10分間遠心することにより、ウイルス上清を回収します。
10. ウイルス上清を新鮮な250mlの遠心分離チューブに慎重に移し、形成された可能性のある細胞ペレットを乱さないように注意してください。
11. ウイルス上清に新鮮なTCMを添加し、最終容量がRHFFコーティングウェルに必要な量より3 mL多くなるようにします。例えば、192個のRHFFコーティングウェルの場合、ウイルス上清の量を192 + 3 ml = 195 mlにします。
12. 培養した脾臓細胞をインキュベーターから取り出し、各ウェルで2〜3回静かにピペッティングして再懸濁します。250mlの円錐形に移します。マルチチャンネルピペットを使用する場合は、移し替え前に滅菌リザーバーを使用すると、このステップを迅速化するのに役立ちます。前述のようにカウントし、300 x gで10分間遠心します。
13. 組換えヒトインターロイキン-2(rhIL-2)をウイルス上清に50 IU/mlの濃度で添加します。例えば、195 ml のウイルス上清に 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2 を加えます。
14. 脾臓細胞をウイルス上清に1 x 10⁶細胞/mLで再懸濁
します。
15. 1 mL/ウェルの脾臓細胞懸濁液をRHFFコーティングされた24ウェルプレートに加えます。
16. 次の設定に従って90分間回転します:770 x g、加速= 4、ブレーキ/減速= 0、32°C。
17. 50 IU/ml rhIL-2 を含む TCM 溶液を調製します。例えば、10,000 IU rhIL-2 を添加して 200 TCM 溶液を調製します。遠心分離後、各ウェルに1 mLのrhIL-2/TCMを加えます。
18. 5% CO₂ 中で 37 °C で一晩培養します。

3. CAR-T細胞の培養と収穫

3日目と4日目:

1. T細胞が>80%のコンフルエンスを達成すると、細胞が分裂する可能性があります(これは通常、3日目または4日目までに発生します)。細胞を分裂するには、各ウェルで2〜3回静かにピペッティングし、各ウェルから1 mLを新鮮な24ウェル組織培養処理プレートの新しいウェルに移します。次に、50 IU/ml IL-2 を含む 1 ml の新鮮な TCM を各ウェルに添加し、すべてのウェルで最終容量が 2 ml になるようにします。
2. 細胞が>80%のコンフルエントに達しない場合は、各ウェルの上部から1 mLの培地をゆっくりとピペッティングして、培地を半分交換します。メディアを取り外すときは、底に沈殿した細胞を邪魔しないでください。50 IU/ml rhIL-2 を含む 1 ml の新鮮な TCM を加えます。

5日目:

3. 各ウェルで3回静かにピペッティングしてCAR-T細胞を再懸濁し、250 mLの遠心チューブに移します。細胞を300 x gで10分間スピンします。
4. ペレットを乱さずに上澄みを完全に吸引します。PBSで1回洗浄し、前述のように細胞をカウントし、2回目にPBSで洗浄します。典型的なCAR-T細胞の収量は、ウェルあたり約1 x 10⁶細胞です(8プレート×24ウェル=192×10^6CAR-T細胞)。
5. 200 μgの容量で1 x 10⁷を注入するために、5 x 10⁷ / mlの濃度でPBSに細胞を再懸濁します(例:192 x 10⁶ CAR T細胞の場合、洗浄したペレットを3.84 mLのPBSに再懸濁します)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コンカナバリンA	シグマ・アルドリッチ	2010年頃	T細胞の増殖とウイルス形質導入を誘導する非特異的マイトジェン
RPMIの1640	ライフテクノロジー	11875-093	T細胞培養培地
ウシ血清アルブミン(BSA)、フラクションV—標準グレード	ジェミニバイオプロダクツ	700〜100P	レトロウイルスのレトロネクチンコーティングプレートへの非特異的結合をブロック
Pharm Lyse(10倍濃縮物)	BDバイオサイエンス	555899	脾細胞のプロセシング中に赤血球を溶解
70 μm 滅菌セルストレーナー	コーニング	352350	脾細胞のプロセシング中に大きな組織粒子をろ過します
100 mm BioCoat 培養皿 (Poly-D-Lysine入り)	コーニング	356469	HEK293細胞の接着を促進し、トランスフェクション後の増殖を最大化
ジメチルスルホキシド	シグマライフサイエンス	D2650	テモゾロミドの完全溶解に必要
塩田	ホスピーラ	IM 0132 (5/04)	テモゾロミドおよびケタミン/キシラジン用溶媒
ケタテシアHCl	ヘンリー・シャイン動物衛生	11695-0701-1	ケタミン溶液
アナセド	ロイド株式会社	該当なし	キシラジン滅菌液100 mg / mL

します