エフェクターTリンパ球をヒト脳腫瘍を持つマウスに導入

要約

出典: Jarry, U., et al. 同所性ヒト膠芽腫多形異形異種移植片のマウスモデルにおける細胞傷害性免疫細胞の定位的養子移行。 (2018年)。

このビデオは、ヒトの脳腫瘍を持つマウスモデルにヒトのエフェクターTリンパ球を投与するための定位固定剤注射技術を示しています。腫瘍担重麻酔マウスを定位フレーム上に配置して、頭蓋骨の注入位置にバリ穴を開けると、腫瘍部位にエフェクターTリンパ球を注入します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 細胞傷害性エフェクターTリンパ球の非特異的増殖

1. フィーダーセルを調製し、35 Gyで照射します。2 x 10⁵ - 4 x 10⁵ エフェクター細胞の刺激には、3つの異なる健康なドナーから10 x 10⁶末梢血単核細胞(PBMC)と1 x 10⁶ Bリンパ芽球様細胞株(BLCL)を調製します。
2. 10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、ペニシリン(100 IU/mL)、ストレプトマイシン(0.1 μg/mL)および300 IU/mL組換えインターロイキン-2(IL-2)を添加したロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地(RPMI)15 mLにフィーダー細胞とエフェクター細胞の両方を再懸濁します。
3. フィトヘマグルチニン(PHA-L)を最終濃度1 μg/mLで添加し、慎重に混合し、ウェルあたり150 μLの細胞懸濁液を96ウェルU底プレートに分配します。
4. 加湿雰囲気下で37°C、5%_CO2でインキュベートします。
5. 培養ウェルに大きな細胞塊が形成されるまで、プレートを毎日チェックします(~7日目)。
6. 新鮮な培地で細胞を1 x 10⁶細胞/mLの培養フラスコに移します。
7. カウント(週に2回)して総細胞数を決定し、新鮮な培地で1 x 10⁶細胞/mLに維持します
   手記：エフェクター免疫細胞は、安静状態(通常は最初の増幅刺激の3週間後)で治療投与の準備ができている必要があります。これらのエフェクター細胞の純度と反応性は、in vivo注射(in vitroアッセイなど)の前に確認する必要があります。

2. 術前エフェクター細胞の調製

1. エフェクター細胞数を確認した後、遠心分離によりエフェクター細胞を50 mLチューブに回収します(300 x gで5分間).
   手記： 損失を補うために、過剰な細胞(例:50 x 10⁶)を調製します。
2. 上清を慎重に取り除き、細胞を15 mLの滅菌PBSに再懸濁し、300 x gで5分間遠心分離して洗浄を行います。
3. 上清を慎重かつ完全に除去し、細胞ペレットを滅菌PBS1 mLに再懸濁します。
4. 再懸濁した細胞を1.5 mLマイクロチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します。
5. ゆっくりとピペッティングして、上清を慎重かつ完全に取り除きます。
6. 細胞ペレットをマウスあたり8 μLの滅菌PBSに再懸濁します
   手記： これは重要なステップです。
7. マイクロピペットを使用して細胞懸濁液の体積を測定します。必要に応じて、滅菌PBS(1用量あたり15μLのPBSに20 x 10⁶細胞)を加え、慎重に混合します。
8. マイクロピペットを使用して、マウスあたりの最終容量が15〜20μL(必須<20μL)であることを確認します。
9. 定位注射まで細胞を氷上に保ちます.
   手記：3時間を超える時点はテストされませんでした。

3. 定位注射

1. 機器のセットアップ
   1. 頭蓋内注射の精度を確保するために、製造元の指示に従って小動物の定位フレームを組み立てて校正します(例:.、注射器のサイズ、必要な容量、注射速度).
      手記：ゆっくりとした注入速度が推奨されます(つまり、2〜3μL / min)。
   2. 微生物安全キャビネット(MSC)の下に材料を取り付けて、機器の無菌性を維持し、マウスを感染から保護します。
      手記： 「等温ブロック」を37°Cの水浴に入れます。このシステムは、手術中のマウスの低体温症を制限します。処置後のケアに必要なヒーティングパッドは、継続的な温度モニタリング中に使用する必要があります。
2. 術前の動物の準備
   1. マウスの体重10μL / gでケタミン(10 mg / mL)とキシラジン(0.1 mg / mL)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.
   2. 動物の完全な麻酔と鎮痛を確認するために、つま先つま先つまみテストを実行します.
      手記：どんな動きも非深部鎮痛の兆候であり、それが発生した場合、手術を繰り返す前にさらに数分が必要です。
   3. マウスに適切に麻酔をかけたら、はさみを使用して手術部位(2つの耳の間、鼻まで)から毛皮を取り除きます。
3. 術前細胞調製
   1. 各注入前にピペットで細胞を慎重に(数回)再懸濁して、細胞の凝集を防ぎます。
   2. 気泡の吸引を避けるために、必要な細胞懸濁液量(15 - 20 μL)を22-Gマイクロシリンジに慎重に引き込みます><。 手記： このマイクロシリンジへの細胞ローディングステップは、注入量のばらつきを最小限に抑えるために重要です。手順と手順の間の個々の注入ごとに細胞をリロードして、細胞凝集を防ぎ、コホート内でのエフェクター細胞の投与数が偶数になるようにします。
   3. 次に、シリンジを適合したシリンジポンプに入れます。
4. 手続き型ケア
   1. ポビドンヨード5%溶液に少なくとも3回浸した綿棒で手術部位を消毒します。
   2. 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの目に潤滑性眼科用軟膏を置きます。.
   3. 麻酔をかけたマウスを定位フレーム上、滅菌プラスチックラップで覆われた暖かい等温ブロックの上に置いて、手術中のマウスの温度を維持し、死亡率を制限します。
      手記：マウスの鼻と歯は、処置中に適切な呼吸の流れを確保するために、歯のバーの上に適切に配置する必要があります。
   4. マウスが歯のバーの上に配置されたら、マウスの耳の下にイヤーバーをしっかりと締めて、頭を固定します。
      手記：鼓膜を傷つけたり、呼吸を損なったりしないように注意してください。
   5. 頭蓋骨の上部に沿って前部から後部に向かって滅菌ハサミで1〜2cmの正中線矢状皮膚切開を行い、頭蓋骨を露出させます。
   6. 注射前に定位局在化のランドマークとして機能する矢状縫合糸と冠状縫合糸(Bregma)の交点を特定します(図1を参照)。
   7. マイクロシリンジをこのポイントの上に置きます。
   8. マイクロシリンジをブレグマの右横2mm、前方0.5mm動かします。
   9. マイクロドリルを使用して、滅菌ドリルビットで頭蓋骨に所定の座標で小さな穴を開けます。脳の外傷を避けるために、表面的なままでいるように注意してください.
      手記：このプロトコルでは、免疫細胞を確立された腫瘍内に注入しました(腫瘍細胞注射の1週間後)。皮膚は再び開く必要があり(瘢痕)、注射は腫瘍細胞の移植に使用されるのと同じ座標で行われます(穴は通常、注射後2週間までまだ存在します)。脳実質に腫瘍細胞とエフェクター細胞を注入するための座標を選択しました。
5. 免疫エフェクター細胞の注入
   1. マイクロシリンジをドリル穴に慎重に挿入し、ゆっくりと動かして、針を硬膜内で3mm前進させ、次に0.5mm後退させて最終的な深さ2.5mmまで後退させてから、エフェクター細胞を注入します。
   2. エフェクターセルの注入を2〜3 μL / minで実行し、注入時間全体にわたってマウスを監視します。
   3. 注入が完了したら、注射針を1 mmだけ引き抜き、マイクロシリンジをさらに1分間所定の位置に保持してから、注入部位からの漏れを防ぐためにマイクロシリンジをゆっくりと完全に引き抜きます
      手記：定位装置から動物を取り出した後、直ちに今後の実験のために注射装置を清掃してください。
6. マウスの術後ケアとフォローアップ
   1. 動物を定位フレームから取り外し、直ちに切開部位にポビドンヨード5%溶液を塗布し、適切な外科的縫合糸で皮膚を閉じます。
   2. 2%リドカインゲルを創傷に直接塗布し、処置後鎮痛のために皮下注射により0.15μg/gのブプレノルフィンを投与します。.
   3. 麻酔をかけたマウスを37°Cに設定された加熱パッドの上のケージに戻して、適切なマウスの体温を維持し、低体温症を防ぎます
      手記：別のハウジングは必要ありません。
   4. マウスが麻酔から完全に回復するまでマウスを監視し、ハウジングルームに移します。
      手記：今日まで、このプロトコルは、予期しない合併症がほとんど発生していないため、十分にサポートされています (注射されたマウスの 5% <)。
   5. マウスを毎日監視し、健康状態の低下が見られたら安楽死させます(例:.、猫背の姿勢、運動能力の低下、衰弱、または大幅な体重減少[≥ 15%])。

結果

図1:マウスの頭蓋骨にある主要な解剖学的ランドマークの写真。 これには、矢状縫合糸(赤線)と冠状縫合糸(青線)と、注射部位の向きを決定するために使用されるそれらの交点(ブレグマ)が含まれます。スケールバーが表示されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBMC			3人の異なる健康なドナーから
BLCLの			3人の異なるドナーから
ロズウェルパークメモリアルインスティテュートミディアム(RPMI)	ギブコ	31870から025
FCSの	ダッチャー	S1810-500
L-グルタミン	ギブコ	〒25030-024
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
IL-2	ノバルティス	プロリューキン
PHA-L	シグマ	L4144
脳定位固定装置用フレーム	ストールティング株式会社	51600
脳定位固定装置用マウスアダプター	ストールティング株式会社	51624
マイクロシリンジポンプインジェクター	WPIの	UMP3-4
NanoFilシリンジ	WPIの	NF34BV-2
NSGマウス	チャールズ川	NSGSSFE07S
ケタミン	メリアル	イマルジェーヌ1000
キシラジン	バイエル	ロンプール 2%
鋏	WPIの	201758
鉗子	WPIの	501215
オムニドリル 115/230V	WPIの	503598
ビクリル 4-0	エチコン	VCP397H
キシロカイン	アストラゼネカ	3634461