CRISPR-Cas9システムを用いたCAR-T細胞の遺伝子改変

要約

出典:Sterner, R. M. et al., CRISPR/Cas9を使用してCAR-T細胞のGM-CSFをノックアウトする。J. Vis. Exp. (2019年度)

このビデオでは、CRISPR-Cas9システムを通じて遺伝子組み換えCAR-T細胞を作成するプロセスの概要を示しています。T細胞にCRISPRおよびCARレンチウイルスを感染させると、標的遺伝子が改変され、キメラ抗原受容体またはCARが合成され、最終的には遺伝子改変CART細胞が形成されます。

プロトコル

1. CART19 セルの生産

1. T細胞の単離、刺激、およびex-vivo培養
   1. すべての細胞培養作業は、適切な個人用保護具を使用して細胞培養フードで行ってください。アフェレーシス中に収集された匿名化された正常なドナーの血液コーンから末梢血単核細胞(PBMC)を採取します。これらはPBMCの実行可能な供給源であることが知られているためです。
   2. PBMCを単離するには、15 mLの密度グラジエント培地を50 mLの密度グラジエント分離チューブに加えます。細胞の捕捉を避けるために、2%ウシ胎児血清(FBS)を含む同量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でドナーの血液を希釈します。
      1. 希釈したドナー血液をコーンから分離チューブに加え、血液と密度勾配培地との間の界面を乱さないように注意します。1,200 x gで10分間、室温で遠心分離します。
      2. 上清を新しい50 mLコニカルにデカントし、最大40 mLでPBS + 2% FBSで洗浄し、300 x gでRTで8分間遠心分離し、上清を吸引し、40 mLのバッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。
   3. メーカーのプロトコルに従って、全自動セルセパレーターを使用して、ネガティブセレクション磁気ビーズキットを介してPBMCからT細胞を単離します。
   4. 単離されたT細胞を培養するには、10%ヒトAB血清(v / v)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(v / v)、および無血清造血細胞培地からなるT細胞培地(TCM)を調製します。0.45 μmの滅菌真空フィルターでろ過し、次に0.22 μmの滅菌真空フィルターで培地を滅菌します。
   5. 0日目(T細胞刺激の日)に、T細胞を刺激する前にCD3/CD28ビーズを洗浄します。洗浄するには、必要な量のビーズを置きます(ビーズ:T細胞の比率が3:1の十分なCD3/CD28ビーズを使用します。ビーズの濃度は可変である可能性があることに注意してください)滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、1 mLのTCMに再懸濁します。
   6. 磁石に接触させて置きます。
   7. 1分後、TCMを吸引し、1 mLの新鮮なTCMに再懸濁してビーズを洗浄します。
   8. この手順を合計3回の洗浄を繰り返します。
   9. 3回目の洗浄後、ビーズをTCM1 mLに再懸濁します。
   10. T細胞を数えます。
   11. ビーズをT細胞に3:1のビーズ:細胞の比率で移します。
   12. 細胞を最終濃度1 x 10⁶細胞/mLに希釈します。
   13. 37°C、5%CO₂で24時間インキュベートします。
2. T細胞トランスフェクションと形質導入
   1. BSL-2+の予防措置を用いて、細胞培養フード、個人用保護具、使用済み材料の漂白剤による消毒(廃棄前)など、レンチウイルスの作業を実施します。
   2. レンチウイルスベクターでキメラ抗原受容体T19(CART19)コンストラクトを取得します.
      手記：ここで利用されているCART19コンストラクトは、市販のタンパク質合成ベンダーを使用して設計され、de novoで合成されました。その後、CARコンストラクトをEF-1αプロモーターの制御下で第3世代レンチウイルスにクローニングしました。一本鎖可変領域フラグメントはFMC63クローンに由来し、ヒトCD19を認識します。CAR19コンストラクトは、第2世代の4-1BB共刺激ドメインおよびCD3ζ刺激(FMC63-41BBz)を有する。
   3. 前述のようにレンチウイルス生産を行います。
      1. 簡単に言えば、レンチウイルスを産生するには、70〜90%のコンフルエンシーに達した293T細胞を利用します。
      2. 目的のレンチウイルスプラスミド15 μg、GAG/pol/tat/revパッケージングベクター18 μg、VSV-Gエンベロープベクター7 μg、プレコンプレックス試薬111 μL、トランスフェクション試薬129 μL、トランスフェクション培地9.0 mLを含むトランスフェクション試薬を室温で30分間インキュベートしてから、293T細胞に添加します。次に、トランスフェクションした細胞を37°C、5%CO₂で培養します。
      3. 13,028 x gで18時間または112,700 x gで2時間超遠心分離することにより、24時間および48時間で回収(900 x gで10分間)、ろ過(0.45 μMナイロンフィルター)、濃縮上清を24時間および48時間で濃縮します。
      4. 将来の使用のために-80°Cで凍結します。
   4. 1日目に、0日目に1 x 10⁶ / mLで刺激されたT細胞のロゼットを分解するために、T細胞を穏やかに再懸濁します。
   5. すべてのレンチウイルス作業に対する適切なBSL-2+予防措置の下で、新鮮または凍結採取したウイルスを刺激されたT細胞に感染の多重度(MOI)3.0で追加します。
3. CAR-T細胞の増殖
   1. 増殖の段階では、形質導入したT細胞を37°C、5%CO₂でインキュベートし続けます。3日目と5日目にCAR-T細胞をカウントし、あらかじめ温めた新鮮なTCMを培養物に加えて、CAR-T細胞濃度を1 x 10⁶/mLに維持します。
   2. 刺激の6日後(6日目)に、磁石を使用して形質導入したT細胞からビーズを取り除きます。T細胞を回収し、再懸濁し、磁石で50 mLのコニカルチューブに1分間置く。次に、上清(CAR-T細胞を含む)を回収し、ビーズを捨てます。
   3. 回収したCAR-T細胞を1 x 10⁶細胞/mLの濃度で培養し、増殖を再開します。
   4. 6日目に、フローサイトメトリーによるCARの表面発現を評価します.
      手記：CARの表面発現を検出するには、ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体による染色や、蛍光色素に結合したCD19特異的ペプチドによる染色など、いくつかの方法を使用できます。ここでは、培養物からアリコート(約100,000個のT細胞)を取り出し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、2%ウシ胎児血清、および1%アジ化ナトリウムで調製したフローバッファーで洗浄します。抗CAR抗体で細胞を染色し、2回洗浄します。細胞を生/死染色およびCD3モノクローナル抗体(OKT3)で染色します。細胞を洗浄し、フローバッファーに再懸濁します。サイトメーターで取得し、形質導入効率を判断します。
4. CAR-T細胞凍結保存
   1. 刺激の8日後(T細胞増殖の8日目)にCAR-T細胞を回収して凍結保存するには、培養細胞を回収します。
   2. 300 x gで5分間スピンダウンします。
   3. 10%ジメチルスルホキシドと90%ウシ胎児血清からなる凍結培地で、バイアルあたり1mLあたり1,000万細胞で凍結培地に再懸濁します。
   4. 冷凍容器で凍結して、-80°Cの冷凍庫で-1°C/分の冷却速度を達成し、48時間後に液体窒素に移します。
   5. in vitroまたはin vivo実験に使用する前に、温かいTCMでCAR-T細胞を解凍します。
   6. 細胞を洗浄してジメチルスルホキシドを希釈して除去し、温かいTCMで2 x 10⁶細胞/mLの濃度に再懸濁します。37°C、5%CO₂で一晩休ませます。

2. 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF ^k/o) CART19 産生

1. GM-CSFを破壊するには、ヒトサイトカインGM-CSFをコードするCSF2遺伝子に対して高い効率を有することが以前に報告されたgRNAのスクリーニングを介して選択されたヒトGM-CSF(CSF2)のエクソン3を標的とするガイドRNA(gRNA)を利用します
   手記：このgRNA(U6プロモーターの下)を含む商業的に合成された研究用グレードのCas9第3世代レンチウイルスコンストラクトを使用しました。このコンストラクトは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含んでいます。gRNAの配列はGACCTGCCTACAGACCCGCCです。
2. レンチウイルスを産生するには、70〜90%のコンフルエンシーに達した293T細胞を利用します。
3. 目的のレンチウイルスプラスミド15 μg、gag/pol/tat/revパッケージングベクター18 μg、VSV-Gエンベロープベクター7 μg、プレコンプレックス試薬111 μL、トランスフェクション試薬129 μL、トランスフェクション培地9.0 mLを室温で30分間インキュベートします。
4. トランスフェクション試薬を293T細胞に添加します。37°C、5%二酸化炭素(CO₂)で培養します。
5. 回収し、遠心分離(900 x gで10分間)、ろ過(0.45 μMナイロンフィルター)、濃縮上清を24時間および48時間で13,028 x gで18時間または112,700 x gで2時間超遠心分離し、将来の使用のために-80°Cで凍結します。
6. 1日目に、T細胞を穏やかに再懸濁してロゼットを分解します。
7. BSL-2+承認のラボで、刺激されたT細胞に凍結または採取したばかりのウイルスを加えて、CAR-T細胞を生成します。CAR19レンチウイルスとCRISPRレンチウイルスを標的とするGM-CSFの両方でT細胞を形質導入します。CAR19レンチウイルスをMOI3で追加します。CRISPRレンチウイルスの滴定は不可能であったため、15 μGプラスミド調製物から生成されたウイルス粒子を使用して、10 x 10⁶ T細胞を形質導入します。
8. ステップ1で説明したT細胞の刺激、増殖、および凍結保存の残りのステップをご覧ください。
9. ピューロマイシン耐性を持つlentiCRISPR編集T細胞の場合、3日目と5日目に、1 mLあたり1 μgのピューロマイシンの濃度で細胞をピューロマイシン二塩酸塩で処理します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CD3 モノクローナル抗体 (OKT3), PE, eBioscience	インビトゲン	〒12-0037-42
CD3 モノクローナル抗体 (UCHT1), APC, eBioscience	インビトゲン	〒17-0038-42
チョイスタクブルーマスターミックス	デンビルサイエンティフィック	C775Y51
CTS(Cell Therapy Systems)ダイナビーズCD3/CD28	ギブコ	40203Dさん
CytoFLEXシステムB4-R2-V2	ベックマン・コールター	C10343	フローサイトメーター
ジメチルスルホキシド	ミリポアシグマ	D2650-100ミリリットル
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	ギブコ	14190-144
Dynabeads MPC-S(磁性粒子濃縮器)	応用バイオシステム	A13346 (英語)
イージー50イージーセップマグネット	STEMCELLテクノロジー	18002
EasySep ヒト T 細胞単離キット	STEMCELLテクノロジー	17951	ネガティブ・セレクション磁気ビーズ、17951RF にはチップとバッファが付属
ウシ胎児血清	ミリポアシグマ	F8067
FITCマウス抗ヒトCD107a	BDファーミンゲン	555800
固定メディウム(ミディアムA)	インビトゲン	GAS001S100
GenCRISPR gRNAコンストラクト: 名前: CSF2	GenScript	該当なし	カスタムオーダー
CRISPRガイドRNA 1;種族: 人間, ベクトル:
pLentiCRISPR v2;耐性:アンピシリン;コピー番号:
高い;プラスミド調製:標準送液:4 μg(無料
料金の)
ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647	インビトゲン	A-21235
https://tide.nki.nl。	デスクトップ遺伝学
ヒトAB血清;男性ドナー;タイプAB;私達	コーニング	35-060-CIの
IFN γ モノクローナル抗体 (4S.B3)、APC-eFluor 780、eバイオサイエンス	インビトゲン	47-7319-42
リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬	インビトゲン	L3000075
LIVE/DEAD 固定式アクアデッドセルステインキット、405 nm励起用	インビトゲン	L34966
リンポプレップ	STEMCELLテクノロジー	7851
モネンシン溶液、1000X	バイオレジェンド	420701
マウス反ヒトCD28クローンCD28.2	BDファーミンゲン	559770
マウス反ヒトCD49dクローン9F10	BDファーミンゲン	561892
マウス抗ヒトMIP-1β PE-Cy7	BDファーミンゲン	560687
Mr.フロスティ冷凍コンテナ	サーモサイエンティフィック	〒5100-0001
NALM6、クローンG5	ATCCの	CRL-3273	急性リンパ芽球性白血病細胞株
ヌクレアーゼフリーウォーター	プロメガ	P119Cの
オリンパス真空フィルターシステム、500 mL、PESメンブレン、0.22uM、滅菌済み	ジェネシー・サイエンティフィック	25から227
オリンパス真空フィルターシステム、500 mL、PESメンブレン、0.45uM、滅菌済み	ジェネシー・サイエンティフィック	25から228
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X), リキッド	ギブコ	31985-070
PE-CF594 マウス対ヒトIL-2	BDホライゾン	562384
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(100X)、液体	ギブコ	〒10378-016
透過化媒体(ミディアムB)	インビトゲン	GAS002S100
PureLink ゲノム DNA ミニキット	インビトゲン	K182001
ピューロマイシン二塩酸塩	MPバイオメディカルズ株式会社	210055210
QIAquickゲル抽出キット	キアゲン	28704
ラット対ヒトGM-CSF BV421	BDホライゾン	562930
ロボセップ-S	STEMCELLテクノロジー	21000	全自動セルセパレーター
SepMate-50(IVD)	STEMCELLテクノロジー	85450
アジ化ナトリウム、5%(w / v)	リカケミカル	7144.8-16
X-VIVO 15 無血清造血細胞培地	ロンザ	04-418Q