T細胞の遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9技術

要約

出典:Agarwal, S., et al. Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオでは、CRISPR-Cas9技術を用いてヒトT細胞の遺伝子編集を行うアッセイを実演しています。初代CD4+およびCD8+ T細胞の混合物をCRISPR-Cas9リボ核タンパク質複合体と組み合わせ、ノックアウトのために特定の遺伝子を標的とします。エレクトロポレーションを行うと、sgRNAはCas9を標的DNA配列に導き、正確なカットを作成します。これらの切断は、細胞の非相同末端結合メカニズムによって修復され、遺伝子ノックアウトにつながります。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ヒトT初代細胞におけるsgRNAの設計と遺伝子破壊

1. CRISPR sgRNAの設計
   手記：いくつかのサーバーとプログラムにより、ターゲット特異的なシングルガイドRNA(sgRNA)の設計が容易になります。このプロトコルでは、CHOCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no)とBroad Institute(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)のgRNAデザインポータルを使用して、クラスター化された等間隔の短い回文反復(CRISPR)sgRNAを設計しました。
   1. 各標的遺伝子について、早期にコードするエクソン配列を標的とする6〜10のsgRNA配列を設計します
      注:sgRNAは、オンターゲット効果が高く、オフターゲット効果が低い必要があります。sgRNAの有効性を判断するための機械学習アルゴリズムは、それぞれわずかに異なる働きをします。したがって、複数のsgRNA設計ツールを比較し、スクリーニングのために6〜10個のsgRNAのリストをキュレーションすることをお勧めします。
2. 初代ヒトT細胞における遺伝子破壊
   1. 健康なボランティアドナーから自家末梢血単核細胞(PBMC)を入手します。プロトコルの概略的なタイムラインを図1Aに説明し、以下で説明します。
   2. 市販のCD4およびCD8選択キットを使用して、CD4+およびCD8+ T細胞を単離します。
   3. CD4+とCD8+ T細胞を1:1の比率で組み合わせ、R10に3x10⁶細胞/mLで一晩インキュベートし、それぞれ5 ng/mLのヒトインターロイキン-7(huIL-7)とヒトインターロイキン-15(huIL-15)を添加します。IL-7およびIL-15は、中枢記憶表現型を促進することが知られており、IL-7およびIL-15で増殖したキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞は、インターロイキン-2(IL-2)増殖したCAR-T細胞と比較して優れた抗腫瘍効果を有するため、IL-7およびIL-15の追加が推奨されます。
   4. 翌日、T細胞をカウントし、5-10 x 10⁶細胞を300 x gで5分間遠心分離します。すべての上清を廃棄し、細胞ペレットを低血清最小必須培地で洗浄します。製造元の指示に従って、ペレットを100 μLのヌクレオフェクション溶液に再懸濁します(材料表)。
   5. 細胞を洗浄しながら、10 μgのCas9ヌクレアーゼと5 μgのsgRNAを室温(RT)で10分間インキュベートすることにより、CRISPR関連タンパク質9(Cas9)およびgRNAとリボ核タンパク質(RNP)複合体を調製します。Cas9とsgRNAのモル比は1:2.4です。Cas9とエレクトロポレーションエンハンサーを含み、sgRNAを含まない模擬コントロールが推奨されます。
      手記： マルチプレックス遺伝子編集は、次のステップで説明するように、各ターゲットに対してRNP複合体を別々に作成し、それらをヌクレオフェクション時に細胞と組み合わせることで、このステップで実行できます。RNP複合体を組み立てるための試薬を選択することは、高いノックアウト(KO)効率を得るための鍵です。例えば、Cas9ヌクレアーゼは異なるベンダーから供給され、オフターゲット効果は異なり、化学的に修飾されたgRNAはT細胞に対する毒性を低下させ、KO効率を高めます。
   6. ステップ 1.2.4 で再懸濁した細胞をステップ 1.2.5 の RNP 複合体と組み合わせ、4.2 μL の 4 μM エレクトロポレーション エンハンサー (ヒトゲノムと非相同な一本鎖 DNA [ssDNA] オリゴヌクレオチド) を 4.2 μL 加えます。よく混ぜてエレクトロポレーションキュベットに移します。気泡はエレクトロポレーション効率を損なうため、避けてください。
   7. パルスコードEH111を使用して細胞をエレクトロポレートします。エレクトロポレーション後、5 ng/mL huIL-7 および huIL-15 を 5x10^{6 cells/}mL で 5x10 添加した R10 の細胞を 12 ウェルプレートで 48 時間インキュベートします。48時間後、T細胞の活性化と増殖に進みます。

結果

図 1.編集されたCAR-T細胞の増殖とその集団倍増。(A)ヒトCART初代細胞におけるCRISPRの編集と製造のタイムライン。 (B)CAR-T細胞の増殖中にコールターカウンターを使用して測定されたMockおよびCRISPR編集CD19 CAR-T細胞の集団倍増(n = 3健康なドナー;KO=ノックアウト) (C) CAR-T細胞の増殖中にコールターカウンターを使用して測定した細胞サイズ(μm3)(n = 3健康なドナー)。(D)模擬CAR-T細胞と編集済みCAR-T細胞の両方でCAR発現を示すCAR染色と複数のドナーの平均を示す代表的なフローサイトメトリープロット。CAR発現は、蛍光色素に結合し、リンパ球/シングレット/生細...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4D-Nucleofactorコアユニット	ロンザ	AAF-1002Bの
4D-核因子Xユニット	ロンザ	AAF-1002X
Cas9-エレクトロポレーションエンハンサー	IDTの	1075915
CD4+ T細胞単離キット	StemCellテクノロジー	15062
CD8+ T細胞単離キット	StemCellテクノロジー	15063
コーニング 0.45ミクロン真空フィルター/ボトル	コーニング	430768
Corning T150 細胞培養フラスコ	ミリポアシグマ	CLS430825
DNAeasy血液および組織キット	キアゲン	69504
グルタマックスサプリメント	サーモフィッシャー	35050061
HEPESの(1メートル)	サーモフィッシャー	15630080
huIL-15	ペプロテック	200-15
huIL-7	ペプロテック	200-07
リポフェクタミン 2000	サーモフィッシャー	11668019
オプティMEM	サーモフィッシャー	31985062
P3 初代細胞 4D-核因子 X キット L	ロンザ	V4XP-3024
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン	サーモフィッシャー	10378016
RPMI1640	サーモフィッシャー	12633012
sgRNAの	IDTの
スパイファイキャス9	アルデブロン	9214

の 名