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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウスの飼育とメンテナンス
- 6-8週齢のNSGマウス(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)。
- 温度、湿度、圧力が制御された部屋で、空気交換、プレフィルター、および高効率微粒子空気(HEPA)フィルター(0.22 μm)を使用して、SPF条件下でマウスを飼育します。
- マウスをオートクレーブ処理された個々のマイクロアイソレーターケージに収容し、プレフィルターとHEPAフィルター(0.22μm)による空気交換を管理できるラックシステムに入れます。
- 70%エタノールで前処理されたクラスIIタイプA2生物学的安全性ヒュームフードでマウスのすべての手順と操作を実行します。アニマルルームで働く前に、シャワーを浴びて清潔なスクラブ、タイベックスーツ、ブーツカバー、ヘアキャップ、フェイスマスク、手袋に着替えてください。手術中は、タイベックスーツの上に手術用ガウンを着用してください。
手記：また、施術前に紫外線(UV)光の除染を行うことも推奨されます。
- 可能であれば、すべての器具と試薬をオートクレーブし、ヒュームフードに移す前に消毒してください。
- 処置中は、動物の個別に換気されたケージをラックから取り外し、消毒
してからドラフトに移してください。
- マウスに放射線照射食を与え、オートクレーブ水を提供します。照射した食品を提供し、必要に応じて追加の照射した食品を補充します。オートクレーブ水は毎週または必要に応じて交換してください。
手記：オートクレーブ酸性水も使用できます。提供した照射済み食の賞味期限は製造後6ヶ月であった。
>2. ヒト化骨髄・肝臓・胸腺(BLT)マウスの作製
>注:hu-BLTマウスの生成については、以前に説明しました。
- 手術当日は、マウスに12cGy/gの体重で全身に放射線を照射します。
- マウスを手術用に準備します。
- 照射した各マウスに、100 mg / kgの使用濃度のケタミンと12 mg / kgの濃度のキシラジンの混合物を与えます。これは、麻酔のための腹腔内(IP)注射により、マウスあたり体重に基づいて130〜170μLの範囲でした。ケタミンとキシラジンの混合物3 mLを調製するには、ストック濃度100 mg / mLの0.27 mLのケタミンと100 mg / mLの濃度のキシラジン0.03 mLを滅菌生理食塩水2.7 mLに加えてよく混合します。注射前に70%イソプロパノールで皮膚を消毒します。.
- 照射した各マウスにブプレノルフィン1 mg / kg体重(半減期72時間、SR-LAB)を皮下注射で投与し、長期的な痛みの管理を行います。
- 放射線を照射した各マウスに、術前の抗生物質予防のためにIP注射でセファゾリン100μL(858μg)を投与します。
- 左腎臓を露出させるために使用される後の手術部位で、マウスの左側、外側、および内側の周りの電動バリカンを使用してマウスの毛を剃ります。
- ペダル反射(つま先をしっかりとつまむ)で適切な麻酔レベルを確認します。
- 手術中の任意の時点で追加の麻酔が必要な場合は、イソフルランガスを3〜5%で投与します。
- 角膜の乾燥を防ぐために、両目に眼軟膏を塗布します。.必要に応じて耳タグを付けます。
- 肝臓と胸腺の組織を左腎臓嚢に移植する手術を行います。
- 手術部位の中心から外側に向かって円を描くようにヨウ素スクラブを塗布することにより、手術部位の皮膚を消毒します。このプロセスを70%イソプロパノールで繰り返し、3回目はヨウ素で繰り返します。
- 鉗子を使用して、最初に1つのヒト胎児の肝臓組織片をトロカールにロードします。次に、鉗子を使用して、ヒト胎児胸腺組織片1つをトロカールにロードします。次に、鉗子を使用して、別のヒト胎児の肝臓組織片をトロカールにロードします。組織は、トロカールの内寸に合うように1〜1.6 mm3にカットする必要があります。
- 鉗子を使って皮膚を持ち上げ、ハサミを使って縦方向に小さな切り込みを入れます。マウスの左側で切り口を1.5〜2cm伸ばします。
- 鉗子を使用して筋肉層を持ち上げ、はさみを使用して縦方向に小さな切り込みを入れます。腎臓を露出させるために必要に応じて切り口を伸ばします。
- 腎臓の周りの脂肪組織を優しくつかむようにして、腎臓を露出させます。腎臓実質に直接触れないでください。
- メスを使用して、腎臓嚢の後端に1〜2mmの切開を行います。
- プリロードされたトロカールを腎臓の長軸に平行な切開部からゆっくりと挿入し、腎臓嚢と腎臓の間の組織を解放します。
- 腎臓と腸を慎重に通常の位置に戻します。吸収性の5/0 P-3(P-13)縫合糸と13 mm 3/8サークルニードルを使用して筋肉層を閉じ、外科用ステープルを使用して皮膚を閉じます。
- 手術後、マウスを清潔なオートクレーブ滅菌済みマイクロアイソレーターケージに入れて回復させます。
- 術後の回復中の熱損失を最小限に抑えるために、マウスの入ったケージを、水を温めて循環させるウォーターポンプに接続された加熱パッドの上に置きます。
- マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを監視します。
- 手術完了から6時間以内に、尾静脈を介して、ヒト胎児の肝臓組織から分離されたCD34+造血幹細胞を注入します。
- マウスをヒートランプで温めます。尾部を70%イソプロパノールで消毒し、1.5〜5個×10個5個/200μLを尾静脈に注入します。
- 注射による出血を止め、マウスをマイクロアイソレーターケージに戻し、マイクロアイソレーターケージをケージラックに戻します
手記：手術後のマウスは、通常、回復中および回復後に、マイクロアイソレータケージごとに5匹ずつ一緒に収容されます。ただし、マウスは、全員が同じ日に手術を受けた場合にのみ一緒に飼育されます。
- マウスを毎日チェックしてください。手術用ステープルを注意深く監視し、必要に応じて交換します。感染や不快感の兆候がないかマウスを注意深く監視します。手術後数日間、マイクロアイソレーターケージの床にオートクレーブ処理された食品を供給します。
- 手術後7〜10日で手術用ステープルを取り外します。イソフルランガスを3〜5%で投与してマウスに麻酔をかけます。ステープルを慎重に取り外してから、抗生物質と鎮痛剤の軟膏をその部位に塗ります。
- ヒト免疫細胞の再構成に9〜12週間待ち、その後、各ヒト化マウスから内側伏在静脈から末梢血を採取します。
- マウスの頭部付近に呼吸用の開口部があり、マウスの背面付近に片方の脚を分離するための開口部がある適切なサイズのプラスチック製コーン拘束具を使用して、意識のあるマウスを拘束します。まずマウスを拘束コーンの頭部に入れ、次に片方の脚を脚の開口部からそっと引き抜きます。
- 分離した脚の内側に70%イソプロパノールをスプレーし、抗生物質と鎮痛軟膏を同じ部位に広げます。
手記：軟膏は、脱毛を必要とせずに静脈の位置を明らかにするのに役立ち、また血滴の形成を助けます。
- 25ゲージの針を90°の角度で使用して静脈を穿刺し、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)コーティングされた採血チューブを使用して50〜100μLの血液を採取します。滅菌ガーゼで部位に圧力をかけることにより、出血を止めます。出血が止まったら、マウスをケージに戻します。
手記：収集される最大血液量は、通常、週に50μL、または2週間ごとに100μLです。
- 採取した末梢血を使用して、hCD45、mCD45、hCD3、hCD4、hCD8、hCD19の抗体を用いたフローサイトメトリーを使用して、ヒト免疫細胞の再構成レベルをテストします。
3. 抗生物質治療
- 抗生物質治療の前に、治療前の糞便サンプルを採取してください。マウスを新しいオートクレーブ滅菌済みマイクロアイソレーターケージに移します。
- 広域抗生物質の新鮮なカクテルを毎日準備します。
- マウスの各マイクロアイソレーターケージについて、新たに調製したメトロニダゾール(1 g/L)、ネオマイシン(1 g/L)、バンコマイシン(0.5 g/L)、およびアンピシリン(1 g/L)を含む250 mLの水を調製します
手記：抗生物質を補給した飲料水には、オートクレーブ滅菌水または滅菌水を使用してください。
- 250mLの抗生物質添加水に9.2gのグレープシュガー甘味ドリンクミックスを加えます。
手記：グレープシュガー甘味ドリンクミックスの使用は、抗生物質の苦味を隠し、マウスの脱水症状を防ぐのに役立ちます。
- 抗生物質とブドウ糖、甘味料入りの飲み物、ミックス、サプリメント、水、マウスを毎日新しいオートクレーブ入りケージに入れます。
手記：マウスは食糞性であり、ケージを毎日交換することで、マウスが腸内細菌を再接種するのを防ぎます。
- ヒトのような腸内細菌叢を最大限に生着させるためには、抗生物質を14日間投与します。抗生物質治療中は、マウスの体重減少と脱水症状を監視します。最初の3〜4日間は体重減少が予想され、その後は治療期間中は停滞が予想されます。脱水症状が発生した場合は、腹腔内注射でマウスに生理食塩水またはリンゲルス溶液を投与してください
手記：他の腸内細菌叢のヒト化プロトコルでは、抗生物質の経口強制経口投与が必要です。マウスの腸内細菌を枯渇させるのに効果的である一方で、飲料水に抗生物質を追加する侵襲性の低い方法が、ヒト化マウスへのストレスを軽減し、より良い結果につながることがわかりました。
>4. ドナーサンプルと糞便移植
- 人間のドナーの糞便サンプルを準備します。
- ヒト化マウスへの糞便移植には、適切に調製された糞便微生物叢移植(FMT)材料の供給源を使用してください。
- FMT製剤を解凍し、嫌気性チャンバー内の嫌気性条件下で分注します。
- 必要に応じて、このステップで糞便サンプルの等量を混合して、偏りのない「ヒト」サンプルを作成します。
- FMT材料の凍結と融解を最小限に抑え、サンプルの分注や混合が必要ない場合は、手順の直前にのみ解凍します。
- ヒト糞便移植
- 14日間の抗生物質治療が完了したら、飲料水をオートクレーブ水に変更し、マウスを新しいオートクレーブケージに移します。毎日のケージ交換を停止し、1〜2週間に一度のケージ交換スケジュールを実装します。
- 抗生物質の中止後24時間後と48時間後に2回の糞便移植を行います。
- 抗生物質治療の24時間後、必要な量のFMT材料を解凍し、経口強制経口投与により各マウスに200μLのFMT材料を与えます。抗生物質の48時間後に手順を再度繰り返します。.
- 残りのまたは残った解凍したFMT材料をヒト化マウスの毛皮またはケージの寝具に広げます。.