多価表示外膜小胞ワクチンの作製

Abstract

出典:Feng, R., et al.SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム。J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオでは、多価表示外膜小胞(OMV)ワクチンを生成する方法を示します。哺乳類細胞をトランスフェクションして、SpyTagおよびポリヒスチジンタグに融合したウイルス抗原を発現および分泌します。次に、これらの抗原をニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)アフィニティーカラムを使用して精製します。精製された抗原は、表面結合型SpyCatcher(SC)タンパク質を発現する外膜小胞と混合されます。複数の抗原がSpyTag(ST)を介してSpyCatcherに共有結合し、抗原を表示するOMVを作り出し、多価ワクチンとして機能します。

Protocol

1. プラスミドの構造

1. SpyCatcher配列をコードするDNA(図1)をアンピシリン耐性pThioHisA-Cytolysin A(ClyA)プラスミド(材料表を参照)のBamH I部位とSal I部位の間に挿入し、プラスミドpThioHisA ClyA-SCを構築します。
2. 以前に発表された報告に従って、合成されたSpyTag-SARS-CoV-2受容体結合ドメイン(RBD)-ポリヒスチジンタグ(Histag)融合遺伝子(図1)をpcDNA3.1プラスミド(材料表を参照)にライゲーションして、プラスミドpcDNA3.1 RBD-STを構築します。

2. OMV-SCの準備

1. 以下の手順でClyA-SC変換を行います。
   1. BL21コンピテント株50μLにpThioHisA ClyA-SCプラスミド溶液5μL(50 ng/μL)を加え、静かに息を吹きかけ、氷上で30分間冷まします。
   2. 溶液を42°Cのウォーターバスに90秒間置き、すぐに混合溶液を氷の上に3分間置きます。
   3. 細菌懸濁液に500 μLのLuria-Bertani(LB)培地を加え、混合後、220 rpm、37°Cで1時間培養します。
   4. アンピシリン(100 μg/mL、材料表を参照)を含むLB寒天プレートにすべての形質転換をプレート化し、37°Cで一晩培養します
      手記：その後の実験では、アンピシリンを培地中で同じ濃度に保った。そうしないと、細菌のプラスミドが失われる可能性があります。
2. OMV-SCプロダクションの場合は、以下の手順を実行します。
   1. プレートから1つのコロニーを単離し(ステップ2.1.4.)、LB(アンピシリン耐性)培地20 mLに注入し、220 rpm、37°Cで一晩培養します。
   2. 細菌溶液(ステップ2.2.1)を2L培地に接種し、対数成長段階(OD₆₀₀nmは0.6〜0.8の間)まで、220 rpm、37°Cで5時間培養します。
   3. 細菌溶液の600 nmでのODが0.6〜0.8に達したら、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、材料表を参照)を添加して細菌溶液の最終濃度を0.5 mMにし、220 rpm、25°Cで一晩培養します。
3. OMV-SC精製を行います。
   1. 細菌溶液を7,000 x g、4°Cで30分間遠心分離します。
   2. 上清を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過し、100 kDの限外ろ過メンブレンまたは中空糸カラムを使用して濃縮します(材料の表を参照)。
   3. 濃縮液を0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心分離機(材料表を参照)を使用して150,000 x g、4°Cで2時間遠心分離し(材料表を参照)、上清をピペットで捨てます。
   4. PBSで沈殿物を再懸濁し、-80°Cで保存します。このソリューションは、-80°Cで長期安定性を維持できます。

3. RBD-STの準備

1. 以下の手順でRBD-STトランスフェクションを実施します。
   1. 適切な真核生物の発現システム(HEK293Fなど)を選択し、回収後、細胞を130rpm、37°Cで一晩培養します。
   2. 20 μLのHEK293F細胞溶液を自動セルカウンター(材料表を参照)に添加し、細胞数を記録し、濃度を1 x 106 cells/mLに調整した後、細胞を130 rpm、37°Cで4時間培養します。
   3. RBD-STプラスミドを0.22 μmメンブレンフィルターでろ過し、300 μgのプラスミドを細胞培養培地(材料表を参照)に最終容量が10 mLになるまで加え、10秒間振とうします。
   4. ポリエチレンイミン(PEI、1 mg/mL、材料表参照)を水浴中で65°Cに加熱し、0.7 mLのPEIと9.3 mLの細胞培養培地を混合し、10 s.
      手記：溶液を激しく振らないでください。そうしないと、結果として生じる気泡がトランスフェクション効率に影響を与える可能性があります。
   5. プラスミド溶液をPEI溶液に加え、混合物を10秒間断続的に振とうし、37°Cで15分間インキュベートします。
   6. 混合物を280 mLの細胞培養培地に加え、130 rpm、37°Cで5日間培養します。
2. RBD-ST精製を行います。
   1. 細胞を6,000 x g、25°Cで20分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を回収します。
   2. カラムに 2 mL の Ni-NTA アガロース(材料表を参照)を満たし、3x PBS で 3 回洗浄します。
   3. 細胞上清にイミダゾール(材料表参照)を添加して最終濃度を20 mMにし、細胞上清を2倍ロードします。
   4. 20 mM のイミダゾールを含む PBS の 3 カラム容量 (CV) を 3 カラム容量 (CV) で洗浄用に加え、洗浄画分を回収します。
   5. 低濃度から高濃度(例:0.3 M、0.4 M、0.5 M)のイミダゾールを含むPBSの3 CVでグラジエント溶出し、各濃度で2回溶出します。
   6. SDS-PAGEを使用して、異なる濃度勾配でRBD-STを同定します。

4. OMV-RBDバイオコンジュゲーションと精製

1. ビシンコニン酸アッセイ(BCA)法によりタンパク質濃度を測定します(材料表を参照)。
   1. 標準的なウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質溶液を2 mg/mLから0.0625 mg/mLに連続希釈し、精製したOMV-SCおよびRBD-STを10倍に希釈し、BCAワーキングソリューションAおよびB(アッセイキットに付属)を50:1(v/v)の比率で混合します。
   2. 希釈したタンパク質溶液(25 μL/well)を加え、BCAワーキング溶液(200 μL/well)と混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
   3. 各ウェルの562 nmでの吸光度(OD)を測定し、標準曲線からタンパク質濃度を計算します。
2. 以下の手順に従って、OMV-SCとRBD-STのバイオコンジュゲーションを行います。
   1. OMV-SCとRBD-STをPBSで40:1(w / w)の比率で混合します。
   2. 垂直に回転させて、混合物を15rpm、4°Cで一晩ブレンドします
      手記：抗原が異なれば、反応する割合も異なる場合があります。抗原の特性に基づいて、さまざまな反応比を試すことができます。

Results

図1:本研究で使用したプラスミド配列。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アンピシリンナトリウム	サンゴンバイオテック	A610028
自動セルカウンター	カウンティスター	バイオ テクノロジー
BCAタンパク質定量キット	CWBIO	CW0014Sの
電気泳動装置	カヴォイ	パワーBV
高速凍結遠心分離機	ビオリッジ	H2500R型
His-Tag マウス mAb	細胞シグナル伝達技術	2366秒
イミダゾール	サンゴンバイオテック	A600277
イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド	サンゴンバイオテック	A600118
Ni-NTA His-Bind スーパーフロー	キアゲン	70691
OPM-293細胞培養培地	オプムバイオサイエンス	〒81075-001
pcDNA3.1 RBD-STプラスミド	武漢ジェネクリート生物技術
リン酸緩衝生理食塩水	ZSGB-バイオ	ZLI-9061
ポリエチレン製リニア	ポリサイエンス	23966から1
染色済みタンパク質ラダー	熱	26616
pThioHisA ClyA-SCプラスミド	武漢ジェネクリート生物技術
Quixstandベンチトップシステム(100 kD中空糸カラム)	GEヘルスケア
SDS-PAGEローディングバッファ(5x)	ビヨタイム	P0015
塩化ナトリウム	サンゴンバイオテック	A100241
サスペンション計器	ライフテクノロジー	フラミキサー
トリプトン	オキソイド	LP0042B
超遠心分離機	ベックマン・コールター	XPN-100
紫外線分光光度計	日立	U-3900
酵母エキス	サンゴンバイオテック	A610961