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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
Balb/cYJ (H2d) ドナーマウスと C57Bl/6 (H2b) レシピエントマウスを使用して、同種異系反応を調べます。マウスは8週齢から12週齢までの実験に使用されます。雌マウスまたは雄マウスを使用してください。同系コントロールは、C57Bl/6 ドナーから C57Bl/6 レシピエントへの大動脈セグメントで構成されます。
1. 寄付者と受取人の準備
>注:ドナーとレシピエントの両方が麻酔をかけられ、移植片の虚血を最小限に抑えるために手術前に準備されます。注射可能な麻酔薬は、吸入麻酔薬の送達に必要な機器による動物の閉塞を防ぐためにプロトコルで使用されます。ただし、必要に応じて、吸入麻酔薬が適切な代替手段です。麻酔薬の最初の注射から、全体の手順が完了するまでに約90分かかります。移植片の虚血時間は30分未満です。
- ケタミン(100 mg / kg;10 mg / ml)とキシラジン(10 mg / kg;1 mg / ml)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.マウスは10〜15分以内に鎮静されます。動物のフットパッドの脂肪部分をつまむことにより、麻酔の深さを評価します。動物が離脱反射を示さなくなるまで、必要に応じて麻酔カクテルの元の用量の1/3を投与します。.すべてのカクテルが投与された後、呼吸数を注意深く監視してください。.手術中は、15分ごとに鉗子で前腹壁をつまんで麻酔のレベルを評価します。マウスは60〜90分間深く麻酔をかけたままにする必要があります。
- 麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの眼に眼用軟膏を塗ってください。
- 腹部の腹側領域である胸部中央部から恥骨にかけて、できるだけ肌に近づけて髪を剃ります。特に肌に傷をつけないように注意してください。脱毛クリームは皮膚に吸収され、炎症を起こす可能性があるため、使用しないでください。
- 動物を仰臥位にして、加熱テーブルまたはパッドの上のタオルの上に置きます。
- 2%クロロヘキシジンを含む予備スクラブで手術部位を清掃します。手術野を最大化するために、広い作業領域を準備します。手術部位の中心からスクラブを開始し、直線的または円形に外側に移動します。ガーゼは廃棄してください。この手順を少なくとも 5 回繰り返します。同じ領域にアルコール準備パッドを塗ります。アルコールが乾いたら、ベタジン溶液で清潔な領域を準備し、滅菌ガーゼで覆います。
2. End-to-Endの吻合手順
- ドナーオペレーション
- 作業全体を通して無菌技術を維持します。使用前に、0.5%加速過酸化水素溶液ですべてのカウンタートップと手術テーブルの表面を清掃してください。使用前に、すべての手術器具、ガーゼ、カーテン、ガウンを包み、オートクレーブしてください。各パックに配置された蒸気滅菌器インジケーターストリップを使用して、機器の無菌性を確認します。滅菌手術用手袋は、手術の合間に使用および廃棄されます。複数の手術の場合は、使用の合間にホットガラスビーズ滅菌器で手術器具を滅菌します。
- ドナーマウスを清潔で薄いプレキシガラスボードの上に置き、滅菌ドレープで包み、手術用顕微鏡で8〜30倍の倍率で観察します。
- セクション1.1で概説されているように適切な外科的麻酔を確保した後、手術を進めます。
- 滅菌ハサミを使用して、恥骨からキシフス突起まで、腹部の縦方向の縦方向の正中線を1本切開します。
- 腹壁を開き、小さなリトラクターを使用して空洞を露出させます。
- 滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して、腸を動物の左側に優しく引っ込め、生理食塩水で湿らせたガーゼで覆います。生殖器官を下方向に動かし、下大動脈と下大静脈(IVC)を見つけます。露出した組織を定期的に生理食塩水で湿らせます。
- 医療用のNo.5鉗子を使用して、大動脈をIVCから分離し、左腎動脈のレベルから分岐部まで分離します。10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用して、大動脈近くの小さな枝を結紮します。
- ドナーの大動脈がIVCから分離されたら、血管を生理食塩水で飽和させ、露出した空洞を湿らせたガーゼで覆い、ドナーを無菌エリアに脇に置きます。ドナーの状態(呼吸機能、心血管機能、麻酔の深さ)を15分ごとに確認します。レシピエントに対する操作を開始し、以下に説明するように大動脈を分離します(ステップ2.2.1から2.2.7)。
- レシピエントの大動脈がIVCから分離され、脇に置かれたら、ドナーを顕微鏡下に戻します。クロスクランプ(関心のあるセグメントの近位および遠位)ドナー大動脈、約5mm間隔、2つの4mm微小血管クランプ付き。
- Vannas-Tubingenのマイクロハサミを使用して、腹部大動脈の小さなグラフトセグメント(長さ3〜4mm)を横断します。
- シリンジに取り付けられた25Gの5/8針を使用して、切除した大動脈をヘパリン処理(100U / ml)生理食塩水で洗い流します。.針先が容器に接触しないようにしてください。
- 大動脈をヘパリン処理(100 U / ml)生理食塩水に氷の上に入れ、脇に置きます。.まだ深い麻酔下にある間に、微小血管クランプを解放します。放血によってドナーを安楽死させます。
- 切除後30分以内にドナー血管を移植します。大動脈のより長い長さを切除することにより、複数のレシピエントに対して1つのドナー血管を使用することは可能ですが、虚血時間を30分未満に保ちます。
- 受信者の操作
- ドナー手術と同様に、手術全体を通して無菌技術を維持します。
- レシピエントマウスを仰臥位にして、滅菌ドレープで包んだ薄いプレキシガラスボードに、手術用顕微鏡で8〜30倍の倍率で置きます。
- 十分な麻酔を確保した上で、離脱反射が認められない場合は手術を進めてください。
- 滅菌ハサミを使用して、恥骨からキシフス突起まで、腹部の縦方向の縦方向の正中線を1本切開します。
- 腹壁を開き、小さなリトラクターを使用して空洞を露出させます。
- 滅菌綿の先端のアプリケーターを使用して、腸を動物の左側に優しく引っ込め、生理食塩水で湿らせたガーゼで覆います。生殖器官を下方向に動かし、腎下大動脈とIVCを特定します。露出した組織を定期的に生理食塩水で湿らせます。
- 大動脈をIVCから分離し、左腎動脈のレベルから分岐部まで分離します。必要に応じて、10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸を使用して、大動脈近くの小さな枝を結紮します。
- クロスクランプ(関心のあるセグメントの近位および遠位)大動脈、約5mm間隔、2つの4mm微小血管クランプ付き。
- Vannas-Tubingenのマイクロハサミを使用して、単一の水平大動脈切開を行い、腹部大動脈の小さなセグメント(0.5mm以下)を切除して、ドナー大動脈グラフトを収容します。
- 切除した大動脈をヘパリン処理(100 U / ml)生理食塩水で洗い流します。.ドナー大動脈移植片は、レシピエントの横断された大動脈端を接続するのに適した長さである必要があります。
- ドナーの大動脈移植片を同所位に置き、ドナーの移植片の端をレシピエントの端まで吻合し、それぞれのグラフトの解剖学的向きをレシピエントの向きに一致させます。
- 血管の外膜をそっとつかみ、医療用No.5鉗子を使用してわずかに掴みます。鉗子を使用して、10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸に取り付けられた針を血管壁の全厚に打ち込み、ドナー大動脈移植片をレシピエントの切除血管に固定します。容器の背面壁が誤って縫い付けられたために容器の開口部が塞がれていないことを確認してください。
- 連続縫合糸の場合は、グラフトの上端と下端の両方に9時位置にステー縫合糸を配置します。3時位置からグラフトの上端から、切除された端部を2つのランニング縫合糸で吻合し、縫合糸をステー縫合糸に固定します。
- グラフトを裏返し、血管の背側部分までランニング縫合を続け、原点の留縫合糸に合わせます。容器にあまり圧力をかけずに固定します。下部吻合のために縫合を繰り返します.
注:中断された縫合糸は、連続縫合糸と同じように開始されますが、ステー縫合糸の間に3つの別々のステッチで血管が吻合される点が異なります。吻合時間は通常20分です。
- 吻合が完了したら、遠位微小血管クランプを解放して逆行性血液を流し、吻合部位の漏出を確認します。漏れがある場合は、すぐにステッチを入れて不良部位を塞いでください。部位に出血がない場合は、近位クランプを外す。
- 移植を検査し、移植片とレシピエントの血管の近位部分と遠位部分に血液閉塞がないことを確認します。ドナーとレシピエントの血管の活発な脈動パターンは、血液が自由に流れていることを示しています。一対の鉗子を使用して、ステー縫合糸の一方の端をそっとつかみ、血管を少し曲げて血管の後壁を検査します
手記：吻合部位の両端で血管壁にしわが寄ってはいけません。クランプを取り外した後の血流不良は、血栓症の兆候です。
- 綿の先端のアプリケーターを使用して腸を腹腔に戻します。.
- CastroviejoニードルホルダーとGraefe鉗子を使用して、連続ステッチを使用して5-0ポリプロピレン縫合糸で腹壁を閉じます。皮下閉鎖を使用して、同じ縫合糸で皮膚層を閉じます。
- 移植完了後すぐにトルブゲシック(1 mg / kg)を投与します。
- アチパメゾール(1 mg / kg)、ケトプロフェン(5 mg / kg)、および温めた乳酸リンゲル液を順にすぐに皮下投与します。.
- 手術後すぐに、マウスを水毛布の下の加熱ケージに一晩(12時間)置きます。麻酔薬の回復期間中は、動物を清潔で乾燥した遮るもののない場所に一人で置きます。ケージ(オートクレーブ済み)に清潔なペーパータオルを敷き、ウォーターブランケットの温度を約20〜22°Cに調整します。ケージの床に乾いたキブルと濡れたキブルを自由に用意します
手記：術後ケアの重要な要素は、動物を観察し、麻酔や手術からの回復中に必要に応じて適切な介入を行うことです。必要なモニタリング強度は動物によって異なり、術後回復の後半よりも即時麻酔薬回復期間中に大きくなる可能性があります。
- 麻酔を受けた動物が完全に回復するまで、継続的に監視します。動物は、補助なしで胸骨の横臥を維持できなければならず、放置される前に落ち着いて痛みがないように見える必要があります。
- ブプレノルフィン(0.1 mg / kg BID)とケトプロフェン(5 mg / kg SID)を3日間皮下投与します。.
- 麻酔からの回復中に、心血管機能および呼吸機能、体温、術後の痛みや不快感を少なくとも3日間監視します。脱水症や電解質の損失を最小限に抑えるために、鎮痛薬やその他の薬物、非経口液剤の投与など、追加のケアが必要になる場合があります。
- 後肢の運動機能を観察することにより、移植手術の成功を評価します。移植の完全な成功には、動物の回復直後に後肢と尾への血流が妨げられず、2日目に後肢の麻痺なしに完全に回復することが含まれます。