血管新生異所性脾臓移植のマウスモデル

要約

出典:Wang, J., et al. 脾臓細胞生物学と移植免疫を研究するための血管新生異所性脾臓移植のマウスモデル。 J. Vis. Exp. (2019年)。

ビデオは、血管新生ヘテロトピック脾臓移植のマウスモデルを生成するための外科的方法を示しています。麻酔をかけたドナーマウスの腹腔を外科的に開いて脾臓を切除します。下大静脈と腎下大動脈を同定し、それらの腰部枝を結紮し、コンジェニックドナーマウスからの脾臓の異所性移植のための開口部を作ります。血管吻合が完了し、移植された脾臓への血流が回復すると、切開部が閉じられ、マウスの回復が監視されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術の準備、麻酔、鎮痛療法

1. 滅菌済みの使い捨てドレープ(45.7 cm x 66 cm)を手術台に置きます。マウスを優しくつかみ、麻酔のためにケタミン(50 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を腹腔内(i.p)に注入し、鎮痛のために0.05 mg / kgのブプレノルフィンを皮下に注射します。.
2. つま先をつまんで麻酔の深さを確保し、カミソリで腹部全体の毛を剃り、マウスを手術用顕微鏡の下で6〜10倍の倍率で滅菌手術台に置きます。

2. ドナー脾臓収穫

1. アルコール調製パッドで腹部を滅菌し、手術用テープで手足を固定し、恥骨から剣状突起まで3〜4cmの正中線垂直皮膚切開をはさみで行います。
2. ペーパークリップで作られた滅菌リトラクターで腹壁を引っ込めます。滅菌綿棒で腸を腹部の右側(外科医の左側)に移動し、脾臓を露出させます。脾臓に付着した短い胃静脈を滅菌低温焼灼で焼灼します(図1A)。37°Cの生理食塩水に浸した滅菌ガーゼを脾臓にかぶせて、脾臓を湿らせます(図1B)。
3. 門脈枝(上膵頭十二指腸静脈および右胃静脈)を結紮することにより、門脈を膵組織(図1C)から分離して動員し、脾静脈から遠位の門脈の周囲に縫合糸を留置する(図1D)。
4. 脾臓を右側にひっくり返して、大動脈と腹腔幹を脾動脈で露出させます(図1E)。肝動脈と胃動脈を結紮することにより、大動脈-セリアック-脾臓動脈を解剖し、動員します。腹腔動脈の近位にある大動脈の周りに縫合糸を配置します(図1F-G)。
5. 下大静脈(IVC)に100国際単位(IU)のヘパリンを注入して全身をヘパリン化し、ヘパリンが効果を発揮するまで3分待ちます。腹腔動脈の近位にある大動脈を結紮し、門脈を横断し、腹部大動脈から腹腔幹の遠位部から10mLのヘパリン化冷(4°C)生理食塩水(10mL / 20秒)を使用して全身を灌流します(図1H)。
6. 関連する大動脈-セリアック-脾臓セグメントと門脈、脾静脈のセグメント、および膵臓組織の小部分とともに、脾臓移植片を一括して収集します。移植前に、移植片を4°C生理食塩水5mLで保存してください。子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。

3. レシピエント脾臓摘出術と脾臓移植

1. 手術用プラットフォームに加熱パッドを置き、温度を37°Cに調整します。加熱パッドの上に滅菌ドレープ(45.7cm x 66cm)を置き、滅菌手術用プラットフォームを作成します。手順2.1と2.2を繰り返して、手術の準備と麻酔を行います。3〜4 cmの正中線を切開し、ステップ2.1およびステップ2.2の説明に従って腹壁を引っ込めます。
2. 滅菌綿棒で腸をマウスの右側に慎重に動かし、レシピエントの脾臓を露出させます。脾静脈と動脈を結紮し、脾臓を切除します。
3. 腸をマウスの左側に慎重に移動させ、湿ったガーゼ(滅菌37°C生理食塩水に浸した)で腸を覆います。腎下大動脈とIVCの腰椎枝を解剖し、結紮します。2つの4mm微小血管クランプを使用して、腎下大動脈とIVCをクロスクランプします。
4. 11-0ナイロン縫合糸を腎下大動脈(全厚)に通し、マイクロハサミで1回切って楕円形の大動脈切開術を創開するために引っ込めます(長さはドナー大動脈の直径と一致する必要があります、図2A)。30 Gの針を使用してIVCを穿孔し、楕円形の静脈切開術を作成し、マイクロハサミを使用して開口部をドナーの門脈と一致する長さに延長します(図2A)。
5. 管腔内血液または血栓(大動脈およびIVC内)を500μLのヘパリン生理食塩水(10単位/ mL)で除去します。.
6. 脾臓移植片をレシピエントマウス腹部の右側に置き、ドナーの大動脈カフとドナーの門脈を慎重に識別します。血管がねじれていないことを確認した後、脾臓移植片を冷たい(4°C)生理食塩水に浸したガーゼで覆います。
7. ドナーの大動脈カフを、2つのステイ縫合糸(11-0ナイロン縫合糸、以下と同じ)でレシピエントの大動脈切開術の近位および遠位の頂点に接続します(図2B、C)。ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈切開術(前壁)の間に連続した11-0ナイロン縫合糸を2〜3回噛んで吻合を行います(図2D)。脾臓移植片をレシピエントの左側に裏返します。ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈切開術(後壁)との間に吻合を行います(図2E)。
8. IVCの内側で4〜5回の連続縫合糸を使用して、ドナーの門脈をレシピエントのIVCの後壁に接続するための吻合を行い、IVCの外側で縫合糸を閉じます(図2F、G)。
9. 容器clを解放しますamps、滅菌綿棒を使用して、脾臓の色が回復するまで出血をタンポナーデします(図2H)。
10. 5-0合成吸収性ビクリル縫合糸で腹部を連続的に閉じます。5-0ナイロン縫合糸で皮膚層を断続パターンで閉じます。
    手記：ステップ3.7〜3.8では、代わりに、最初にドナーの門脈とレシピエントのIVCとの間に吻合を行います(ステップ3.8)。次に、ドナーの大動脈カフとレシピエントの大動脈切開術の後壁との間に、大動脈の内側に2〜3本の連続縫合糸を使用して吻合を行い、大動脈の外側の縫合糸を閉じます。

4. 動物の回復

1. 腹部を閉じた後、4つの別々の場所(0.25 mL /場所)を介して1 mLの温かい生理食塩水を皮下に注入します。.
2. マウスを操作後最初の数時間は温度制御されたインキュベーター(30°C)に保管し、マウスが十分な意識を取り戻すまでマウスを監視し、その後、マウスを通常の餌と水で新しい清潔なケージに移し、ケージの下に加熱パッド(30°C)があります。手術後のマウスは別のケージに保管してください。

5. 術後の疼痛管理

1. 0.05 mg / kgのブプレノルフィンを術後24時間および48時間に皮下注射して、鎮痛レジメンを維持します。.

結果

図1:ドナーの脾臓の収穫。 (A)脾臓に付着した短い胃静脈を焼灼します。(B)脾臓を湿らせておくために、滅菌済みの温かい湿ったガーゼの小片を脾臓の上に置きます。(C)膵臓の後ろの門脈を解剖して分離します。(D)門脈の側枝を結紮し、脾臓静脈の遠位にある門脈の周りに縫合糸を配置します。破線は、レシピエントIVCとの吻合のために後でトランスセクトする位置を表しています。(E)脾臓を腹部の右側(外科医の左側)にひっくり返して、大動脈と腹腔幹とその枝を含む脾臓動脈を露出させます。(F)大動脈-腹腔-脾臓動脈を解剖し、他の2つの枝を結紮することにより動員します。(G)腹腔動...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン	ワイス	206205から01
キシラジン	ロイド研究所	139から236
ヘパリン溶液	アブラクシス医薬品	504031
注射グレードの生理食塩水	ホスピーラ株式会社	NDC番号 0409-4888-20
70%エタノール	Pharmco Products Inc.(ファルマコプロダクツ株式会社)	111000140
ThermoCare小動物用ICUシステム	サーモケア株式会社
アドソン鉗子	Roboz手術器具	RS-5230
Derf ニードルホルダー	Roboz手術器具	RS-7822
極細マイクロ解剖ハサミ	Roboz手術器具	RS-5881
マイクロクリップ	Roboz手術器具	RS-5420
7-0 シルク	ブレインツリー・サイエンティフィック	SUT-S 103
11-0ナイロン、4mm(3/8)針	シャーポイントDR4	AK-2119
Ms CD45.2抗体	BDバイオサイエンス	553772
Ms CD45.1抗体	BDバイオサイエンス	553776
Ms CD11b抗体	BDバイオサイエンス	557657
Ms B220抗体	BDバイオサイエンス	553089
Ly6C抗体	eバイオサイエンス	〒48-5932-80
Ly6G抗体	BDバイオサイエンス	561236
Ms F4/80抗体	BDバイオサイエンス	565614
Ms CD11c抗体	BDバイオサイエンス	558079
Ms CD3抗体	eバイオサイエンス	〒48-0032-82
MSのCD4抗体	BDバイオサイエンス	552051
Ms CD8抗体	BDバイオサイエンス	563786
LIVE/DEAD™ フィックスタブル バイオレット デッドセルステインキット	サーモフィッシャー	L34955