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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会と JoVE 獣医審査委員会によって審査されています。
1. デンマークのカルメット・ゲラン菌 (BCG) および結核菌 H37Rv の定量グリセロールストックの調製
注: 記載されているすべてのプロトコルは、バイオセーフティ レベル 3 (BSL3) 条件下で実行されました。
- BCGデンマーク株またはH37Rv株の凍結グリセロールストックを解凍し、Tween-80 0.05%(v / v)およびADC(アルブミン、デキストロース、カタラーゼ)10%(v / v)を添加した10mlの7H9培地に100 μlを接種します。
培養物が- 対数期成長になるまで、37°Cで静的条件下で1週間インキュベートします。
- 10ml培養物を200mlの新鮮な培地に移すことにより、細菌培養をスケールアップします。静的条件下でさらに20日間インキュベートします。
- 50ml遠心分離管に移し、2500 x g で15分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細菌ペレットを残留量に再懸濁します。各チューブに滅菌された直径3mmのガラスビーズを追加します(チューブあたり10〜15個)。
- 細菌の塊を解離させるために、1分間激しく渦を巻きます。各ペレットを10mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にTween-80 0.05%(v / v)で再懸濁します。
- チューブを10分間放置して、最大の細菌凝集体とガラスビーズを落ち着かせます。
- 小さな塊と単一の細菌を含む4本のチューブのそれぞれから9.5mlの上清を回収し、容量を単一の新鮮な50ml遠心分離管(最終回収量38ml)に移します。400 x g で 10 分間遠心分離します。
- 35 mlの上清(主に単一の細菌を含む)を単一の新鮮な50 ml遠心分離管に回収し、グリセロール50%(v / v)を含む15 mlのPBSを添加して、15%(v / v)の最終グリセロール濃度を取得します。
- 穏やかに混合し、冷凍用の適切なチューブに1mlのアリコートで分配します。-80°Cで保存します(1ロットで約50アリコートのグリセロールストックを提供します)。
- グリセロールストックを定量するには、凍結の翌日にグリセロールを解凍し、900 μlのPBSを含む別々の1.5mlチューブで7回の10倍の連続希釈を行います。
- 直径55 mmのペトリ皿で調製したADC 10%(v / v)を添加した7H10固体寒天培地に各希釈液100 μlをプレートします。
- 直径3 mmのガラスビーズ(プレートあたり約10個)を慎重に追加し、プレートを軽く振って寒天プレート全体に体積を均等に分散させます。ビーズを廃棄し、寒天プレートをパラフィルムで密封します。
- 37°Cで21日間インキュベートし、単一コロニーを正確に区別できる希釈液中のコロニー形成単位(CFU)をカウントすることにより細菌濃度を測定します。
2. マウスワクチン接種
- 事前に定量化されたBCGグリセロールを解凍し、PBSで希釈して2つの懸濁液を調製します。動物あたりの用量が皮下投与の場合は 100 μl (皮下ワクチン接種の場合は 10 7 CFU/ml)、鼻腔内投与の場合は 40 μl (鼻腔内ワクチン接種の場合は 2.5 x 107 CFU) であることを考慮して最終容量を計算します。
- げっ歯類専用の麻酔ワークステーションを使用して、イソフルランと酸素の混合物でマウスを麻酔します。イソフルラン5%を使用して麻酔を誘導し、2%を使用してマウスを麻酔室に維持します。(他の受け入れられている麻酔法を使用することもできます)。
- 皮下ワクチン投与の場合は、1 ml の注射器に 26 G の針に 1 ml の細菌懸濁液 (107 CFU/ml) を充填します。気泡を取り除きます。
- 麻酔をかけたマウスを層流フード内の腹臥位の平らな面に置き、マウスの背中の脇腹に100 μl(106 CFU /用量)のワクチンを皮下接種します。マウスをケージに戻し、監視して、麻酔から適切に回復していることを確認します。
- マウス投与のたびにシリンジ針を交換します。上記のように気泡を除去しました。
- 鼻腔内投与の場合は、麻酔をかけたマウスをフード内に仰臥位に置きます。
- マイクロピペットを使用して、2.5 x 107 CFU / mlで20 μlの懸濁液を取ります。全容量が沈着するまで、接種物を2つの鼻孔の間に一滴ずつ置き、マウスが容量を吸い込むことができるように滴下の間に時間を残します.
注:マウスはこの手順中に呼吸困難に苦しむ可能性があるため、マウスは可能な限り防ぐために次の滴を投与する前に各滴を吸収するように放置する必要があります。
- マイクロピペットにさらに20 μlを再度充填し、操作を繰り返します。最初の接種後にマウスが麻酔から目覚め始めた場合は、2回目の接種の前に麻酔室に入れます。マウスをケージに戻し、麻酔から適切に回復することを確認します。
3. H37Rv 株によるマウス鼻腔内チャレンジ
- 事前に定量化されたH37Rvグリセロールを解凍し、PBSで希釈して、mlあたり2,500 CFUの細菌懸濁液を調製します。動物あたりの用量が40 μlであることを考慮して最終容量を計算します。
- H37Rvは、2.5〜2.7に記載されているように鼻腔内接種されます。マウスあたりの最終チャレンジ用量は 102 CFU/40 μl です。