ラットモデルにおける広範囲にわたる大脳皮質脱髄の生成

要約

出典:Üçal, M. et al., Rat Model of Extensive Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、広範囲にわたる大脳皮質の脱髄を伴うラットモデルを生成する方法を示しています。これには、組換えミエリン鞘タンパク質でプライミングされたマウスに炎症誘発性サイトカインを注入することにより、血液脳関門を破壊することが含まれます。このプロセスは免疫細胞の浸潤を促進し、広範囲にわたる大脳皮質の脱髄をもたらします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 材料の準備

>注:手術は無菌条件下で行われます。開始する前に、ドリルビットを含むすべての手術器具が適切な消毒剤で洗浄されていることを確認してください。

1. 麻酔薬混合物を準備します:0.02 mg / mLのフェンタニル、0.4 mg / mLのミダゾラム、および0.2 mg / mLのメデトミジン(混合物の最終濃度)。
   注:代替麻酔薬については、それぞれのディスカッションセクションを参照してください。
2. 解毒剤混合物を準備します:0.07 mg / mLのフルマゼニルと0.42 mg / mLのアチパメゾール(混合物の最終濃度)。.
3. カテーテルとカテーテルキャップをインレットとネジで組み立てます。カテーテルをメスで2mmの長さに切断します(図1)
   注:ハサミはカテーテル先端の円形の断面形状を圧迫して歪めるため、これにはハサミを使用しないでください。

2. 手術の準備

1. 麻酔薬混合物(体重1.5 mL / kg)の腹腔内投与によりラットに麻酔をかけます。.
2. 電気シェーバーを使用して耳の間のネズミの頭を剃ります。動物を配置する前に、定位フレームにホメオサームブランケットを敷き、手術中の低体温症を防ぎます。
3. イヤーバーとバイトプレートを使用してラットの頭を定位フレームに固定し、頭が水平で安定していることを確認します。指または鉗子で頭蓋骨に圧力を加えて安定性を確認します。
   注:定位フレーム内での固定が緩み、水平でない位置に配置されると、意図した座標からずれる可能性があります。
4. 手術中の角膜の乾燥を防ぐために、潤滑性の点眼薬を塗布します。手術用の光にさらされないように、目を不透明な素材で覆います。
5. 70%エタノールと10%ポビドン-ヨード錯体を交互に塗布して、剃った部分をきれいにします。
   注:感染を避けるために、手術中はすべての予防措置に従ってください。手術は無菌条件下で行われます。無菌が壊れている場合は、汚染された材料を交換する必要があります。

3. カテーテルの埋め込み

1. 頭の皮膚の中央に長さ約2cmの縦切開を行います。ブルドッグクランプを使用して、皮膚を側面に保持します。これらの手順の概要については、図 2 を参照してください。
2. 綿の先端のアプリケーターを使用して血液を取り除きます。
3. 頭蓋骨骨膜を切除します。コットンチップのアプリケーターでティッシュを洗い、頭蓋骨を露出させます。頭蓋骨を約1分間乾かします。
4. 解剖学的ランドマーク、ラムダ、ブレグマ、および内側縫合糸を特定します。ドリルを定位フレームに取り付けた状態で、ドリルチップをBregmaを出発点として位置付けます。ブレグマから 2 mm 後方に移動し、内側縫合糸に対して横方向に ~2.4 mm 移動します。
5. この位置にカテーテル用の直径0.5mmの穴を開けます。骨の粉をそっと吹き飛ばします.
   注:掘削中、硬膜が無傷のままであることが重要です。これを確実にするためには、1)定位フレームに取り付け可能なドリルを使用し、2)穴あけ中に頻繁に穴を点検し、3)小さなステップでドリルダウンします。頭蓋骨に過度の圧力がかかると、頭蓋骨が完全に貫通したときにドリルの先端が続き、脳に損傷を与えます。
6. アンカーネジ用の穴(直径~1.3mm)をさらに3つドリルで開けます(直径~1.3mm)最初の穴から数ミリメートル離れています。骨の粉をそっと吹き飛ばします。
   注:カテーテルの上部(直径~2mm)とアンカースクリューの上部(~1mm)に十分なスペースを確保できるアンカースクリューの位置を選択してください。
7. シリンジを使用して、約1〜2mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または生理食塩水を使用して洗浄することにより、骨粉を取り除きます。頭蓋骨をきれいにします。アンカーネジを2〜3回転締めます。
   注:アンカースクリューは、歯科用セメント、つまりカテーテルを所定の位置に保持することにより、セットアップを安定させるために必要です。アンカーネジを締めるときは、鉗子で軽く上に持ち上げて、簡単に取り外せないようにします。カテーテル自体の埋め込みは組織の外傷を引き起こすため、アンカースクリューをドリルで穴を開けたり締めたりする際に追加の硬膜損傷が発生すると、複数の外傷性損傷が発生し、グループ内での比較可能性が妨げられる可能性があります。最初にアンカーネジを締め、最後にカテーテルを挿入します。
8. 長さ2mmのカテーテルを頭蓋骨表面に垂直な最初の穴に挿入します。カテーテルを保持したまま、少量の歯科用セメントを塗布し、歯科硬化光に短時間(~5秒)さらして重合させてカテーテルを安定させ、次のステップで両手を使用できるようにします。
   注意：歯科用硬化ライトを使用する際は、この光の強度が高いと網膜の損傷を引き起こす可能性があるため、先端を直接見たり、塗布領域から反射された光を見たりしないでください。適切な保護メガネを使用してください。
9. カテーテルの周囲に歯科用セメントをさらに塗布し、ネジを固定し、歯科用硬化ライト(~15 - 30 秒)で歯科用セメントを固めます。鉗子の先端でセメントの硬化を確認します。

4. 傷口の閉鎖と麻酔の拮抗

1. カテーテルの前方と後部にある吸収性縫合糸で頭の皮膚を閉じます。
   注:移植の最後に頭蓋骨の上にでこぼこしたセットアップがあるため、それに応じて創傷閉鎖を行います。皮膚を持ち上げすぎると、動物に不快感を与えます。
2. 解毒剤混合物を皮下(1.5 mL / kg体重)に、26 Gの針が付いた1 mLの注射器を使用して
注射します。.
3. 予防的抗生物質治療のために、皮下注射(7.5 mg / kg体重)によりエンロフロキサシン(2.5%)を投与します。.皮下注射による痛みの緩和のために、カルプロフェン(1 mg / mL; 5 mg / kg体重)とブプレノルフィン(1.2 mg / kg)を投与します。.

5. 術後のケアと投薬

1. 動物を改造したケージに戻し、低体温を避けるために赤外線を当てて 1 時間から 3 時間観察します。術後の回復まで、5 分から 10 分ごとに動物を常に観察し、体位を変えます。回復するまで、目に常に光が当たらないように特に注意してください。
2. 手術の翌日に、エンロフロキサシン(7.5 mg/kg体重)とカルプロフェン(1 mg/mL、5 mg/kg体重)を繰り返し皮下注射で投与します。ブプレノルフィンは、以前の治療が72時間有効であるため、リフレッシュする必要はありません。

6. 免疫剤の調製(カテーテル留置後14日後)

>注:準備手順中にシリンジを氷の上に置きます。

1. 2つの10 mLルアーロックチップガラスシリンジを3方向ストップコックの短いアームに接続し、長いアームで3番目のコンセントを閉じます。
2. 接続が安全で漏れがないことを確認します:ピストン2を保持しながら、開いたシリンジに約4 mLの滅菌PBSを追加します。ピストン1を挿入し、漏れがないか確認しながら両方のピストンを前後に押します。漏れがない場合は、PBSを廃棄し、再度ピストン1を取り外してください。
3. 不完全なフロイントアジュバント(IFA)1 mLと組換えミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(rMOG_1-125)50 μgを一緒にピペットで入れ、適切なチューブに滅菌PBS(pH 7.4)を入れて混合物を最終容量2 mLに調整します。
   注:調製中にシリンジの先端または壁にエマルジョンが失われるため、投与に意図した量よりも多くの量を準備してください。.同様に、一度に複数の動物を準備する方が実用的です。
4. 希釈したIFAとrMOG_1-125の混合物をオープンシリンジに入れます。反対側のピストンに緩い圧力をかけたまま、ピストンを静かに挿入します(図3A)。
5. 接種物を一方のシリンジからもう一方のシリンジに駆動し、ピストンを前後に押して白く粘性になるまで乳化します(図3B)。
6. 1 mLのルアーロックシリンジを3方向ストップコックの開いた短いアームに固定し、接種物で満たします(図3C)。すべての接種材料を1mLシリンジに分配します。注射まで氷の上に置いてください。調製の日に混合物を投与する。

7. 予防接種

1. チャンバー内でイソフルランでラットに麻酔をかけ (~2 分、酸素 2 L/分と混合)、マスク (酸素 1.5 L/分と混合) で麻酔を維持します。
2. 21Gの針を使用して、尾根に200μLの接種材料を皮下注入します
   注:溶液が粘性であるため、注射をゆっくりと投与します。.

8. 脳内サイトカイン注射

1. コネクタカニューレの長さ(2 mm)を調整します。(準備手順については、図 4 を参照してください。
2. 1 mLシリンジにサイトカイン混合物(500 ng/μLの腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、300 U/μLの組換えラットインターフェロン-γ(IFN-γ)の滅菌PBS)を満たします。.シリンジをコネクタカニューレに接続します。カニューレにサイトカイン混合物を入れます。気泡を避けてください。
3. シリンジをプログラム可能なシリンジポンプに取り付け、0.2μL/minを注入するようにプログラムします(図5A)。カニューレの先端に気泡が形成されないように、ポンプを始動し、作動させ続けます。
   注:注入速度は、使用する特定のシリンジの内径を考慮に入れる必要があります。そのため、ポンプのセットアップ中にシリンジの直径を登録する必要があります。
4. チャンバー内でイソフルランでラットに麻酔をかけ(~2分間、2 L/分の酸素と混合)、次にマスク(1.5 L/分の酸素と混合)で麻酔を維持します(図5Bおよび5C)。動物は少なくとも30分間麻酔されるため、潤滑点眼薬を塗布します。
5. インレットでカテーテルキャップを取り外します。.コネクタカニューレをカテーテルに挿入し、ねじ込んで締めます(図5Dおよび5E)。
   注:カテーテルの上部先端が破壊されるため、締めすぎないでください。
6. 注入を10分間進行させます(注入の総量は2μLです)。ポンプを停止します。カニューレをカテーテル内に20分間放置して、注入されたボリュームが完全に拡散するのを待ちます。
7. コネクタカニューレを緩め、真空の影響を避けるためにゆっくりと取り外します。
8. カテーテルキャップをインレットに再度取り付け、ねじ込みます。動物がケージの中で麻酔から回復するのを待ちます。

結果

図1:カテーテルの準備。(A・B)ガイドカニューレとダミーカニューレ(インレット付きカテーテルキャップ)を組み立ててねじ込みます。(C)次に、カテーテルをメスを使用して2mmのサイズに切断します。顕微鏡観察の結果、ハサミを使用するとカニューレ先端の円形が歪むため、避けなければならないことがわかりました。

図2:カテーテルの埋め込み。(A)手術は、縦方向の切開と骨膜の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
成体の雄のダークアグーチラット(300 ±25 g)
フェンタニル	Hameln pharma plus、ドイツ		クエン酸フェンタニルとして、50μg/ml
ミダゾラム	ERWO Pharma(オーストリア	50039017	5 mg / ml
メデトミジン	オリオンファーマ、フィンランド		メデトミジン塩酸塩として、1mg / ml
フルマゼニル	ロシュ(スイス		0.1 mg / ml
アチパメゾール	オリオンファーマ、フィンランド		塩酸アチパメゾールとして、5 mg / ml
10%ポビドン-ヨード複合体	Mundipharma, オーストリア
歯科用セメント	ヘレウス・クルツァー(ドイツ)	6603 7633
生理食塩水	Fresenius Kabi, オーストリア		0.9%NaCl
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich, ドイツ	P3813
イソフルオラン	AbbVie, オーストリア
潤滑点眼薬	Thea Pharma(オーストリア)
70%EtOH	Merck, ドイツ	1070172511	無水エタノールをddH2Oで希釈して、70% v/vを調製しました
2.5%エンロフロキサシン	バイエル(ドイツ)		予防的抗生物質
カルプロフェン	ファイザー社(米国)		鎮痛剤、50 mg / ml
Tween-20 (トゥイーン 20	Sigma-Aldrich, ドイツ	P9416
ペントバルビタール	Richter Pharma(オーストリア		ペントバルビタールナトリウム、400 mg / ml
インターフェロンガンマ	PeproTech, アメリカ	400から20
腫瘍壊死因子アルファ	R&Dシステムズ、米国	510-RT-050/CF
rMOG1-125	スウェーデンのカロリンスカ研究所の分子医学センターでの自社製品		組換えラットミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、N末端由来のアミノ酸1-125、市販品:AnaSpec、AS-55152-500、米国
不完全なフロイントのアジュバント	Sigma-Aldrich, ドイツ	F5506
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich, ドイツ	A9576の
ペルオキシダーゼ基質溶液	ベクターラボラトリーズ(米国)	SK-45000
定位フレーム	David Kopf Instruments(米国)
カテーテル、MRI対応	PlasticsOne, アメリカ	8IC315GPKXXCの
ダミーカニューレ	PlasticsOne, アメリカ	8IC315DCNSPC
プラスチックネジ、MRI対応	PlasticsOne, アメリカ	8L080X093N01
コネクタカニューレ	PlasticsOne, アメリカ	8IC313CXSPCC
先端サイズ2mmのドライバー
フレキシブルシャフトエクステンション付きドリル	Proxxon, ドイツ	NO28 472、NO28 706、NO28 620、
ドリルビット、丸型、0.5 mm	Hager & Meisinger, ドイツ	レフ310 104 001 001 009
ドリルビット、ツイスト、1.3 mm	Hager & Meisinger, ドイツ	レフ350 104 417 364 013
メス	ブラウン(ドイツ)	BB510 (英語
メスのハンドル	ファインサイエンスツール、ドイツ	91003から12
コットンチップアプリケーター	Henry Schein Medical、オーストリア	〒900-3155
手術用ハサミ	ファインサイエンスツール、ドイツ	14101-14、14088-10
外科用鉗子	ファインサイエンスツール、ドイツ	11002-12、11251-35
ブルドッグクランプ	ファインサイエンスツール、ドイツ	18050-35
ホモエオサーミックブランケット	TSE systems(ドイツ)
赤外線ランプ	Beurer, ドイツ	616.51
歯科用光重合器	桂林ウッドペッカーメディカル、中国
吸収性縫合糸	Johnson & Johnson, ベルギー	V792E
プログラム可能なシリンジポンプ	World Precision Instruments社(米国)	AL-1000
試験用手袋
手術衣
電気シェーバー	Aesculap, ドイツ	GT420
揮発性麻酔気化器	Rothacher Medical、スイス	履歴書30-301-D
揮発性麻酔薬気化器用酸素源	エア・リキード(オーストリア)	19,113
揮発性麻酔チャンバー	Rothacher Medical、スイス	PS-0347
ラット用麻酔マスク	Rothacher Medical、スイス	PS-0307-A
1mlシリンジ	Codan, デンマーク	参照番号 62.1612
注射用26ゲージ針	ブラウン(ドイツ)	4657683
サイトカイン注射および免疫のための20ゲージ針	ブラウン(ドイツ)	4657519
ルアーロックチップガラスシリンジ	Poulten & Graf, ドイツ	7.140-37
3ウェイストップコック	ベクトン・ディキンソン(スウェーデン)	394600
37°Cインキュベーター	Kendro, ドイツ	50042301
マイクロピペット	Gilson, アメリカ	F167350