細菌性病原体に感染したex vivoヒツジブチ傷皮膚モデルの生成

要約

出典: Regan, H. C., et al. A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics. J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオは、黄色ブドウ球菌に感染したex vivoのヒツジの皮膚モデルの生成を示しています。これには、子羊の額の皮膚生検切片を抗生物質で治療し、創傷床を確立し、抗生物質を含まない培地を含むマルチウェルプレートの透過性膜に配置し、皮膚創傷に細菌感染を確立することが含まれます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 滅菌

1. 清潔な鉗子を取り、200°Cのオーブンで乾熱滅菌を行い、ヘッドの収集前に鉗子を消毒します。使用前に121°Cで15分間オートクレーブします。
2. 記載されているすべての作業を微生物学クラス2キャビネット内で実行します。すべての試薬は、製造元の指示に従って調製してください。

2. サンプルコレクション

1. 屠殺場では、スウェールデールの子羊が電気やキャプティブボルトピストルを使用してスタニングで屠殺され、放血されました。屠殺後4時間以内に子羊の頭を集めます。

3. ヘッドの準備

1. 子羊の額部分を消毒するために、200ppmの二酸化塩素溶液を約100mLサンプル領域に注ぎます。電動バリカンを使用して頭の額部分を剃り、200 mLの200 ppm二酸化塩素溶液でその部分を洗います。
2. エタノールとブルーロールでその部分を拭き取り、サンプル領域を脱毛クリームで35分間覆います。髪の毛が大量に残っている場合は、脱毛作業を繰り返します。
3. さらに200mLの二酸化塩素溶液を使用して領域をすすぎ、次にエタノールですすぎ、青いロールで拭きます。
4. 滅菌済みの8mm生検パンチを使用して、準備した領域から8mmの皮膚サンプルを切り取ります。滅菌鉗子と15枚刃メスを使用してサンプルを取り出し、皮膚の脂肪がすべて除去されていることを確認します。
5. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填した滅菌0.5Lジャーにサンプルを入れ、200ppmの二酸化塩素溶液50mLを入れた滅菌50mLチューブに移し、2回反転させて30分間滅菌します。
6. 二酸化塩素溶液からサンプルを取り出し、40 mLの滅菌PBSで満たされた50 mLチューブに入れて洗浄します。洗浄したら、個々の皮膚サンプルを24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。
7. 予熱した培地350μLを、サンプルを気液界面に維持しながら加えます。培地の組成は次の通りです:MK培地(ハンクス塩、L-グルタミン酸、および1.75mg / mL重炭酸ナトリウムを含むミディアム199)とハムのF12を1:1の比率で添加し、ウシ胎児血清(FBS、10%v / v)、上皮成長因子(EGF、10ng / mL)、インスリン(5μg / mL)、ペニシリン-ストレプトマイシン(100U / mL)、 およびアンホテリシンB(2.5μg / mL)。
8. 24ウェルプレートをガス透過性プレートシールでシールし、加湿した5% CO₂組織インキュベーターで37°Cで最大24時間インキュベー
トします。

>4. 皮膚サンプルの維持

1. インキュベーション後、培地を取り出し、500 μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でサンプルをすすぎます。各サンプルに抗生物質を含まない培地を添加し、加湿した5% CO₂組織インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートして、サンプル中に残留する抗生物質を除去します。
2. 24時間後に抗生物質を含まない培地で濁りや真菌感染が発生した場合は、サンプルを廃棄してください。

5. 接種材料の準備

1. 10mLの滅菌トリプシン大豆ブロスを含む50mLのチューブを準備します。黄色ブドウ球菌の新鮮な寒天プレートを取り、綿棒を使用していくつかのコロニーをブロスに移します。150 rpmで37°Cで18時間インキュベートします。
2. 4,000 x gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、細胞ペレットを10 mLの滅菌PBSに再懸濁します。細胞が適切に洗浄されるように、2回繰り返します。
3. 滅菌PBSで接種材料を0.6 OD₆₀₀に調整します。手動で実行可能なプレートカウントを行うことにより、接種負荷を確認します。

>6. 皮膚サンプルの感染

1. 400 μLの温め済みの抗生物質を含まない培地を入れた新しい24ウェルプレートを調製し、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートを添加します。
2. 皮膚サンプルから培地を取り出し、500 μLの滅菌PBSで洗浄し、洗浄液を取り除きます。滅菌鉗子を使用して、サンプルをウェルの底に優しく保持します。
3. 4 mmパンチ生検を使用して、中央の創傷フラップを作成し、1〜2 mmの大まかな深さまで突き刺します。次に、15枚刃のメスと滅菌歯付きアリス組織鉗子を使用して、創傷フラップの最上層を取り除きます。創傷寸法の変動性は、感染およびエンドポイントコロニー形成単位(CFU)の結果に影響を与える可能性があります。
4. すべてのサンプルが傷ついたら、滅菌鉗子を使用して24ウェルインサートに移します。15 μL の細菌接種物を創傷床にピペットで移します。次に、加湿した5%_CO2組織インキュベーターで37°Cで24時間インキュベートします。
5. より長いインキュベーション期間が必要な場合は、培地を取り外して24時間ごとに新しい培地と交換し、同じ条件でインキュベートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24ウェルコンパニオンプレート	SLSの	353504
4mm生検パンチ	ウィリアムズメディカル	D7484
50mlの遠心分離管	フィッシャーサイエンティフィック	10788561
8mm生検パンチ	ウィリアムズメディカル	D7488
アムホテリシンB溶液、滅菌済み	シグマ	A2942(英語版)
カラープロスタイルコードレスバリカン	ヴァール	〒9639-2117X	バリカン
デュアルオーブンインキュベーター	SLSの	OVe1020	滅菌オーブン
上皮成長因子	SLSの	E5036-200UG
エタノール	ハネウェル	458600-2.5L
F12ハム	シグマ	N4888
ウシ胎児血清	ラボテックインターナショナル	CA-115/500
鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	15307805
脱毛クリーム	ヴィート	該当なし
ヘラセル VIOS 160i	サーモサイエンティフィック	15373212	組織培養インキュベーター
ヘレウス メガフュージ 16R	VWRの	〒521-2242	遠心機
インディビジュアル 24 ウェル 0.4um メンブレンを挿入	VWRインターナショナル	353095
インスリン、組換えヒト	SLSの	91077C-1Gの
ミディアム199(MKメディア)	シグマ	M0393
マイクロプレート、細胞培養Costar 96ウェル	フィッシャーサイエンティフィック	10687551
マルチトロン	インフォラー	該当なし	細菌インキュベーター
PBSタブレット	シグマ	P4417-100TAB
ペニシリン-ストレプトマイシン	SLSの	P0781
プレートシール	フィッシャーサイエンティフィック	ESI-B-100
セーフ 2020	フィッシャーサイエンティフィック	1284804	クラス II微生物学用安全キャビネット
メス刃数15	フィッシャーサイエンティフィック	O305
メススワンモートン	フィッシャーサイエンティフィック	11849002
炭酸水素ナトリウム	シグマ	S5761-1KGシリーズ
歯付きアリス組織鉗子	ロシアル	RSPU500-322
トリプシン大豆スープ	メルクライフサイエンスUKリミテッド	41298-500G-F
Vimobaタブレット	Quip ラボ	VMTAB75BX

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