CRISPR Cas9を用いたナチュラルキラー細胞の遺伝子編集技術

要約

出典: Naeimi Kararoudi, M., et al. Cas9 リボヌクレオタンパク質を用いたノックアウト初代および拡大ヒトNK細胞の生成 J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、Cas9リボ核タンパク質を介したプライマリーナチュラルキラー(NK)細胞の遺伝子改変の技術を示しています。CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)の塩基対形成によって形成されたガイドRNA(gRNA)に結合したCas9エンドヌクレアーゼからなるCas9リボ核タンパク質を、エレクトロポレーションによりプライマリーナチュラルキラー細胞に導入します。リボ核タンパク質は、標的部位で宿主DNAを標的にして切断し、細胞修復装置による標的遺伝子の改変により遺伝子ノックアウトを引き起こします。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ヒトNK細胞の精製と増殖

1. 末梢血単核細胞(PBMC)をBuffy Coatから単離します。
   1. 15 mLのFicoll-Paqueに35 mLのバフィーコートサンプルを重ねます。
   2. ブレーキなしで400 x gで20分間遠心分離し、インターフェースからPBMCを回収します。
   3. 少なくとも等量のPBSを添加し、400 x gで5分間遠心分離し、PBC洗浄を吸引することにより、回収したPBMCを3回洗浄します。NK細胞は、この段階でRosettesSepによって単離できます。
2. 0日目、7日目、14日目に10 x 10⁶ mbIL21発現フィーダー細胞を照射して刺激することにより、NK細胞を増殖させます。10% FBS、1% グルタミン、1% ペニシリン ストレプトマイシン、および IL-2 100 IU/mL を含む新しい RPMI とメディアを 1 日おきに交換します。

2. gRNAの設計と選択

1. NCBI、Ensembleなどのオンラインツールを使用して、ターゲットとする特定のゲノム遺伝子 座を選択します。
   例。
   説明文: トランスフォーミング成長因子ベータ受容体2(TGFBRR2)エクトドメイン
   レコードの表示: PF08917
   InterProの表示:IPR015013
   ポジション: 49 - 157 aa
   標的配列:TGFBR2遺伝子のエクソン4(ENSG00000163513)
2. gRNAを設計するには、http://crispr.mit.edu や「Benchling」などのCRISPR設計ウェブツールを使用します。
   1. ステップ2.1で選択したDNA配列を入力します。ターゲットゲノムとしてヒト(hg 19)を選択します。CRISPR ガイド (20 ヌクレオチドとそれに続くプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 配列: NGG) は、以前に入力した配列からスキャンされます。また、選択したゲノム全体でオフターゲット一致の可能性も示します。
   2. オンターゲット率とオフターゲット率に基づいて、スコアが最も高い3つのgRNAを選択します。例えば、表1は、CRISPR設計ウェブツールによって提案されたTGFBR2遺伝子のエクソン4を標的とするように設計されたCRISPR RNAを示しています。
3. CRISPR RNAを合成配列特異的crRNAとしてご注文ください。
4. 保存されたトランス活性化RNA(tracrRNA)を注文して、crRNAと部分的な相同性を介して相互作用させます。

3. デザイン削除スクリーニング入門

1. T7E1 変異アッセイのための gRNA 切断部位にまたがるプライマーを設計します。
2. 予測された切断部位から少なくとも100 bp離れた場所でプライマーを使用して、突然変異アッセイ後にsgRNA標的部位の小さな挿入欠失(インデル)が1.5%アガロースゲルに現れることを確認します。表2は、TGFBR2エクトドメインを増幅するために使用されるプライマーを示しています。

4. ヒト初代および拡大NK細胞の形質導入

>注: Cas9/RNPs要素のNKへの変換は、以下のように4Dシステムを使用したエレクトロポレーションによって行われます。

1. 細胞調製
   1. 初代NK細胞については、新たに単離したNK細胞をロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地で100 IU/mLのIL-2存在下で4日間インキュベートし、5日目にエレクトロポレーションを行います。メディアは、前述の通り、および形質導入の前日に隔日で交換してください。
   2. NK細胞を増殖させる場合は、0日目にフィーダー細胞を1:1の割合で照射し、5日目、6日目、7日目にエレクトロポレーションを行います。メディアは、前述の通り、および形質導入の前日に隔日で交換してください。
   3. エレクトロポレーションの日に、エレクトロポレーションを受ける細胞用に、100 IU/mL の IL-2 を含む 8 mL の新鮮な RPMI を充填した T25 フラスコを調製し、加湿した 37 °C および 5% CO₂ インキュベーターでフラスコをインキュベートします
      手記： 解凍された細胞または2回目または3回目の刺激を受けた細胞は、説明したように、回復後いつでもエレクトロポレーションできます。
   1
   4. 条件あたり3 - 4 ×^{10 6}細胞を26 μLの形質導入ミックスに取ります><。 手記：エレクトロポレーション溶液中のNK細胞の濃度が非常に高くなると、形質導入率が向上します。
   5. 細胞をPBSで3回洗浄して、一般的にRNase活性を含むすべてのFBSを取り除きます。それらを毎回300 x gで8分間回転させます
      手記：Cas/RNPの7つのエレクトロポレーション条件を、単一のgRNA(gRNA1、gRNA2、gRNA3)と2つのgRNA(gRNA1+gRNA2、gRNA1+gRNA3、gRNA2+gRNA3)の組み合わせ、およびCas9/RNPを含まない1つのコントロールとして考えてみましょう。
2. crRNA:tracerRNA/complexを形成する
   1. crRNA(gRNA1、gRNA2、およびgRNA3)とトレーサーRNAを1x TE溶液中に最終濃度200 μMに再懸濁し、表3に示すように、各200 μM gRNAを2.2 μLずつ200 μMトレーサーRNAと混合します。
   2. サンプルを95°Cで5分間加熱し、ベンチトップで室温(15〜25°C)まで冷却します。再懸濁したRNAおよびcrRNA:tracrRNA/complexを-20°Cで保存し、後で使用してください。
3. RNP複合体を形成します
   注:時間を節約するために、洗浄ステップ4.1.5でRNP複合体を形成します。
   1. 単一のcrRNA:tracrRNA二本鎖反応の場合、表4の例に示すように、Cas9エンドヌクレアーゼを36 μMに希釈します。
   2. crRNA:tracrRNA二本鎖のコンビネーション形質導入では、表5の例に示すように、Cas9エンドヌクレアーゼを36 μMに希釈します。
   3. Cas9エンドヌクレアーゼをcrRNAに添加します:tracrRNA二本鎖をピペットチップを回転させながら、30秒から1分かけてゆっくりと
   進めます。
   4. 混合物を室温で15〜20分間インキュベートします。インキュベーション後に混合物を使用する準備ができていない場合は、使用するまで混合物を氷の上に置いてください。
4. エレクトロポレーション
   1. サプリメント全体をエレクトロポレーション溶液P3に加え、室温に保ちます。
   2. セルペレット(ステップ4.1.5の3 - 4 × 10⁶細胞)を20 μLのP3一次4Dエレクトロポレーション溶液に再懸濁します。ピペッティング中は気泡を避けてください.
      注:セルをP3溶液に長時間放置しないでください。
   3. 直ちに5 μLのRNP複合体(ステップ4.3)を細胞懸濁液に加えます。
   4. 100 μM Cas9エレクトロポレーションエンハンサー1 μLをCas9/RNPs/cell mixに加えます。
   5. Cas9/RNP/細胞ミックスを20 μLのエレクトロポレーションストリップに移します。
   6. ストリップを軽くたたいて、サンプルがストリップの底を覆っていることを確認します。
   7. 4Dエレクトロポレーションシステムを起動し、EN-138プログラムを選択します。

>表 1.TGFBR2エクトドメインのエクソン4を合成crRNAとして標的とするように設計された3つのgRNA。

gRNA番号	gRNA配列	合成crRNAとして注文
gRNA1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArGrGrUrGrArGrArGrGrUrUrUrArGrArGrGrCrUrArGrGrU/AltR2/
gRNA2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrGrGrCrArGrArGrCrUrUrUrArGrArGrGrCrUrArGrGrCrUrArGrCrU/AltR2/
gRNA3	5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/

>表 2.TGFBR2エクトドメイン遺伝子の増幅に用いるプライマー

TGFBR 2 エクトドメインプライマー FWD	5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3
TGFBR2 エクトドメインプライマー REV	5 GGG CCT ギャグ AAT CTG CAT TTA 3

>表 3.200 μM RNAを使用してcrRNA:tracrRNA/complexを形成

名

コンポーネント	金額 (uL)
200 μM crRNA	2.2
200 μM トレーサー RNA	2.2
IDTEバッファ	5.6
最終製品	10

>表 4.単一crRNA:tracrRNA二本鎖反応の場合、Cas9エンドヌクレアーゼを36 μMに希釈します。

コンポーネント	量(μL)
PBSの	1
crRNA:tracrRNA二本鎖(ステップ4.2以降)	2 (200 pmol)
Alt-R Cas9 エンドヌクレアーゼ (61 μM ストック)	2
総ボリューム	5 UL

>表 5.crRNAの併用形質導入の場合:tracrRNA二本鎖はCas9エンドヌクレアーゼを36μMに希釈します。

コンポーネント	量(μL)
PBSの	1
crRNA:tracrRNA二本鎖(例:gRNA1)	1(100 pmol)
crRNA:tracrRNA二本鎖(例:gRNA2)	1(100 pmol)
Alt-R Cas9エンドヌクレアーゼ	2
総ボリューム	5 μL

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ロゼットセップ™ヒトNK細胞濃縮カクテル	STEMCELLテクノロジー	15065	RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktailは、ネガティブセレクションにより全血からNK細胞を分離するように設計されています。
フィコール・パケ®・プラス	GEヘルスケア - ライフサイエンス	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	統合DNAテクノロジー	1072532	独自の化学修飾を含むTracrRNAは、ヌクレアーゼ耐性を増加させます。crRNAにハイブリダイズしてCas9酵素を活性化します
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	統合DNAテクノロジー		遺伝子を標的とする遺伝子を標的とした設計済みgRNAの配列に基づいて、Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNAとして合成的に作製
Alt-R® ゲノム編集検出キット	統合DNAテクノロジー	1075931	各キットには、T7EIエンドヌクレアーゼ、T7EI反応バッファー、およびT7EIアッセイコントロールが含まれています。
Platinum® Taq DNA ポリメラーゼハイフィデリティ	インビトゲン	〒11304-011
4D-ヌクレオフェクター™システム	ロンザ	AAF-1002Bの
ヒト組換えIL-2タンパク質	ノバルティス	65483-0116から07
P3 初代細胞 4D-ヌクレオフェクター™ X キット	ロンザ	V4XP-3032	pmaxGFP™ベクター、ヌクレオフェクター™溶液、サプリメント、16ウェルヌクレオキュベット™ストリップが含まれています
ノンターゲティング:カスタム siRNA、標準 0.05 2mol ON-TARGETplus	ダルマコン	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9ヌクレアーゼ3NLS	統合DNAテクノロジー	1074181	Cas9ヌクレアーゼ
DNeasy® 血液組織ハンドブック	キアゲン	69504
RNeasyミニキット	キアゲン	74104
カルセインAM	サーモフィッシャー	C3099
TGFβ	バイオレジェンド	580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 コントロールキット、ヒト	統合DNAテクノロジー	1072554	tracrRNA、HPRTポジティブコントロールcrRNA、ネガティブコントロールcrRNA#1、HPRTプライマーミックス、およびヌクレアーゼフリーデュプレックスバッファーが含まれます。
IDTE pH 7.5 (1X TE 溶液)	統合DNAテクノロジー	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 エレクトロポレーションエンハンサー	統合DNAテクノロジー	1075915	Cas9エレクトロポレーションエンハンサー