ワクチン用の組換え弱毒生インフルエンザウイルスの作製

Abstract

出典:Pérez-Girón, J. V. et al, 粘膜免疫を研究するためのキメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与。J. Vis. Exp. (2015年度)

このビデオでは、寒冷適応型組換えインフルエンザウイルスを作成する方法を紹介しています。これには、ヒト細胞に双方向プラスミドをトランスフェクションした後、低温でインキュベーションして、暖かい条件下での複製が減少するという特徴を持つワクチン製造に適したウイルスを生成するというものです。

Protocol

1. リバースジェネティクスによる組換え弱毒生インフルエンザワクチンの生成

>注:逆遺伝学による組換えインフルエンザウイルスの生成に関する詳細なプロトコルは、以前の研究によって説明されており、このレポートの範囲外です。簡単に言うと、寒冷適応型インフルエンザワクチン(CAV)の救出は、バイオセーフティレベル2(BSL2)の封じ込め下にあるバイオセーフティクラスIIキャビネットで行われ、以下に詳述する手順が含まれます。

1. 寒冷適応株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)、赤血球凝集素(HA)、A/PR/8/34(H1N1)株の改変ノイラミニダーゼ(NA)を背景として、再集合体寒冷適応インフルエンザワクチンを作製します(図1A)。NA遺伝子の修飾は、タンパク質茎(残基65〜72)の保存された配列を、ニワトリオボアルブミン(OVA)由来ペプチドSIINFEKLをコードする短いcDNA配列にPCRベースで置換することで構成されます(図1B)。SIINFEKLペプチドは、C57BL/6マウスのH-2b MHCクラスI制限応答の文脈で非常に免疫優性なペプチドです。
2. 10.ペニシリン/ストレプトマイシン(P / E)を添加したDMEM 10%ウシ胎児血清(FBS)を使用して、6ウェルプレートでウェルあたり^{10 6} 293T細胞をプレートします。
3. プラスミドトランスフェクション混合物を調製する:インフルエンザA/Ann Arbor/6/60株由来のPB2、PB1、PA、NP、M、NSのcDNAをコードするプラスミドをそれぞれ1 μgずつ加え、インフルエンザA/PR/8/34株のNA-SIINFEKLおよびHAをコードするプラスミドを1 μg加えます。予熱したOpti-minim必須培地(Opti-MEM) (最終容量100 μl/ウェルで15 μl) を添加します。
4. トランスフェクションミックスをRTで30分間インキュベートします。
5. トランスフェクションミックス/ウェル100 μlを加え、37°Cおよび5% CO₂で16時間インキュベー
トします。
6. DMEM 0.3% BSA 1% P/E で 33 °C および 5% CO₂ で 5 時間、細胞培地を交換。
7. L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン(TPCK-トリプシン)で処理したウシ膵臓由来のトリプシン1μg / mlを含むジメチルスルホキシド(DMSO)に10個の⁶インフルエンザ許容性マディン-ダービー犬腎臓(MDCK)細胞を加えます。.293T-MDCK共培養物を33°Cおよび5%CO₂で2〜3日間維持します。
8. MDCK-293T細胞共培養物の上清を回収し、260 x gで5分間遠心分離して透明にします。

Results

図1.トレーサブルLAIVのエンジニアリング。(A)アンビセンスプラスミドにクローニングされたインフルエンザセグメントを、Lipofectamine 2000を用いて293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、293T細胞から得られた上清を使用して、1%のTPCKトリプシンの存在下でインフルエンザ耐性のMadin-Darby犬腎臓(MDCK)細胞をコーティングしました。次に、MDCK細胞からのウイルス上清を9日齢のニワトリ卵に3日間、33°Cで接種しました。PCRベースのウイルスゲノム増幅およびシーケンシングにより、ウイルスのレスキューを確認しました。(B)OVA由来のSIINFEKLペプチドをインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)に挿入するために、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)ウ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM 1X)	Gibco RL-Life テクノロジー	41965-039
オプティMEM	Gibco RL-Life テクノロジー	31985-047
リポフェクタミン 2000	Invitrogen-Life テクノロジー	〒11668-027
ペニシリン-ストレプトマイシン(10.000 U / ml)	PAAの	P11-010
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A2153の
ジメチル-スルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D2650
トリプシン-TPCK	シグマ・アルドリッチ	T1426