腫瘍スフェロイドにおける浸潤T細胞の三次元共培養モデル

要約

出典:Lin, Y., et al. 3D培養におけるがん細胞の浸潤とT細胞の細胞毒性のモニタリング。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、腫瘍スフェロイドとT細胞の三次元共培養を確立する方法を示します。腫瘍スフェロイドを含むマイクロウェルを有するアガロースキャストを調製し、続いてT細胞を添加する。インキュベーション後、このセットアップにより、制御された3次元環境でT細胞と腫瘍スフェロイドとの相互作用を研究することができます。

プロトコル

1. 回転楕円体の生成

1. 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (例: 1x PBS 50 mL に 1 g アガロース) で 2% アガロースを調製し、オートクレーブ処理し、35 マイクロウェルおよび 81 マイクロウェル ゴム型をオートクレーブ処理します
   注意：免疫組織化学(IHC)プロセシング用のアガロースキャストの生成に低融点アガロースを使用することは避けてください。
2. アガロースキャストを準備します
   注:35マイクロウェルキャストは、浸潤、免疫蛍光(IF)、および細胞単離アッセイに使用されます。81マイクロウェルキャストは、細胞毒性、IHC、細胞単離、リボ核酸(RNA)抽出アッセイに使用されます。
   1. アガロースをオートクレーブした後、溶融したアガロースを約60-70°Cまで冷まします。細胞培養フードで、無菌技術を使用し、500 μLの溶融アガロースをウェルあたり81マイクロウェルゴム型にピペットで、または330 μLをウェルあたり35マイクロウェルゴム型にピペットで移します
      注意：アガロースの混合またはピペッティング中に気泡を作らないようにしてください。静かにピペッティングして気泡を取り除きます。
   2. アガロースが固まったら、ゴム型を慎重に曲げて、アガロースキャストを取り除きます。これにより、適切なウェルプレートの上に手を置き、アガロースキャストをウェルプレートの1つのウェルに正しく落とします。
      手記：過度の屈曲を避けるために、ゴム型をさまざまな位置で曲げます。ゴムの型を曲げると同時に、下から優しく押すと便利かもしれません。
   3. アガロースキャストを平衡化するために、10%ウシ胎児血清(12ウェルプレートで2.5 mL/ウェル、24ウェルプレートで1 mL/ウェル)を添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)からなる細胞培養培地を添加します。ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れ、1時間インキュベー
   トします。
3. その間、播種のための細胞培養を準備します.
   手記：アガロースキャストあたりの総細胞播種数は、研究者が決定します。マウス初代膵臓がん細胞株については、35,000細胞/35マイクロウェルキャストおよび81,000細胞/81マイクロウェルキャスト(平均1000細胞/スフェロイド)を以下のすべてのアッセイに播種します。回転楕円体の平均直径は、48時間後に約150-2000μmです。
4. まず、ウェルプレートを傾けて、アガロースキャストを囲む細胞培養培地をP1000ピペットで取り出します。次に、播種チャンバー内の培地を慎重に取り出します。
5. 調製した腫瘍細胞懸濁液を細胞播種チャンバーに滴下して慎重に播種します。ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に15分間
   手記：このステップでは、細胞はアガロースキャストのマイクロウェルに落ち着きます。
6. アガロースキャストの外側に追加の培地を追加します(12ウェルプレートの場合は2.5 mL/ウェル、24ウェルプレートの場合は1 mL/ウェル)。
7. ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に48時間
   戻します 手記：通常、細胞がマイクロウェル内でスフェロイドを形成するのに最大数時間かかります。一般に、固形腫瘍細胞スフェロイドは24時間後に形成され、48時間後に安定です。ただし、これは細胞株によって異なる場合があります。必要に応じて、アガロースキャストの入ったウェルプレートを慎重に傾け、P1000ピペットで周囲の細胞培養培地を取り出して、細胞培養培地を交換します。次に、ウェルの壁に沿ってピペッティングして、新鮮な培地を慎重に加えます。通常、キャスト内のメディアは容量が小さく、回転楕円体を除去するリスクがあるため、交換する必要はありません。

>2. T細胞との共培養

1. 必要な数のT細胞を、75 μL(35マイクロウェルキャスト)または190 μL(81マイクロウェルキャスト)の適切なT細胞培養培地(RPMIに10%ウシ胎児血清と100ユニット/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加)に再懸濁します。
2. まず、ウェルプレートを傾けて、アガロースキャストを囲む細胞培養培地をP1000ピペットで取り出します。次に、もう片方の手でウェルプレートを傾けたまま、P200ピペットで播種チャンバーの片隅を優しく狙い、キャスト内の培地をゆっくりと慎重に取り出します。
3. (重要なステップ1)スフェロイドを除去するリスクがあるため、培地を除去する前と後のマイクロウェル内のスフェロイド数を10倍倍で顕微鏡で観察し、スフェロイドの損失を抑制します。
4. P200ピペットをキャストの約0.5cm上に保持することにより、T細胞懸濁液をアガロースキャストの播種チャンバーに慎重に播種します。
5. (重要なステップ2)T細胞を添加する際にスフェロイドが洗い流されるリスクがあります。したがって、T細胞を非常にゆっくりと、播種室の約0.5cm上に配置することが重要です
   手記：洗い流されるスフェロイドの数を減らす1つの可能性は、T細胞を追加するときにピペットを播種チャンバーの1つのコーナーに向けることであり、したがって、このコーナーのスフェロイドが洗い流されるリスクのみがあります。
6. ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO₂)に15分間慎重に戻します。
7. ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、新鮮な細胞培養培地(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地(RPMI)に10%ウシ胎児血清と100ユニット/ mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加)をアガロースキャストの周囲に、ウェルの壁に沿ってゆっくりとピペッティングして加えます。
8. ウェルプレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dペトリ皿	マイクロティッシュ株式会社	Z764019 & Z764051	プロトコルでは「ゴムモールド」と呼ばれ、81マイクロウェルおよび35マイクロウェルモールド
8ウェルチャンバースライド	ラボテック	154534
アガロースタイプI、低EEO	シグマ・アルドリッチ	A6013
DMEM、ウシ胎児血清	サーモフィッシャー	11965092, 16000044	プロトコールでは「細胞培養培地」と呼ばれます
RPMI(ルプミ)	サーモフィッシャー	11875093	T細胞培養液

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