免疫関連遺伝子のマウス皮膚組織への導入による免疫関連遺伝子の送達

要約

出典:Lin, Y., et al., Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、マイクロニードルを用いた鍼治療を通じて、プラスミドDNAをコードするインターロイキン-15をインターロイキン-15欠損マウスモデルの皮膚組織に直接転写する方法を示しています。これらのマイクロニードルは、皮膚の最も外側の層にマイクロパンクを生成し、プラスミドDNAの皮膚組織内のケラチノサイトを含む表皮細胞への吸収とトランスフェクションを促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. お問い合わせ方法

>注:最適なDNA量と標的皮膚表面の面積は、遺伝子によって異なる場合があり、さらに最適化する必要があります。皮膚の角質層をほぐすための刺す力や回数も、皮膚の厚さによって異なる場合があります。これらの条件は、qRT-PCRによってacufected遺伝子転写産物の発現レベルを評価した後、慎重に決定する必要があります。

1. マウスの体重を量り、腹膜注射によりトリブロモエタノール(体重1グラムあたり400μg)を投与します
   注:2,2,2-トリブロモエタノールは、マウスで一般的に使用されていた注射可能な麻酔薬です。溶液は、非医薬品グレードの2,2,2-トリブロモエタノール(2.5g)を2.5%の2-メチル-2-ブタノールを含む蒸留水(200mL)に溶解することによって作られます。
2. 麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医眼科軟膏を使用してください.
   手記：麻酔効果は1〜2分で誘発されます。手術前に足の指のピンチ反射をチェックして、十分な麻酔の深さを確認してください。
3. 背側の脇腹の皮膚を剃り、脱毛クリームを塗って毛幹のケラチンタンパク質を溶かします
   手記： 脱毛クリームを使用して脱毛すると、皮膚へのDNAの注入が容易になります。
4. 水に浸したコットンボールを使用して、脱毛クリームを拭き取ります.
   手記：脱毛クリームは水に溶けます。クリームを完全に取り除くと、表面が脂っこくなるのを防ぎ、より良い刺し傷結果が得られます。
5. 70%エタノールに浸した滅菌綿棒を使用して、皮膚表面を消毒します。
6. 脱毛した皮膚のターゲット領域(1 cm x 1 cm)に、事前に測定したステンシルで印を付けます。手記：ターゲット部位をマークすると、定義された領域内で針束を上下に適用するのに役立ちます。これは、実験間のばらつきを最小限に抑えるために、特定の表面積に同量のDNAを確実に送達するために重要です。
7. 10 μLのプラスミドDNA(10 μg)をマーキングした皮膚に置きます><。 手記： 鍼術用のDNAの量は、遺伝子や発現ベクターの種類によって異なります。目的の実験を行う前に、使用するDNAの量を慎重に滴定する必要があります。10μLは小さな液滴で、剃毛して脱毛した肌にしっかりと馴染み、刺しながら転がり落ちることはありません。10 μLの空のベクターDNAで処理したマウスの対照群を含め、研究遺伝子で鋭く切除したマウスと比較します。
8. 鍼の束(図1B)を持ち、マークされた表面を上下に100回、または皮膚のPBS中のDNAからの水分が消えるまで刺します。手記：皮膚表面に赤みが生じる場合があります。にじみのある深い切り傷は避けてください.
   皮膚表面の上下の刺し傷運動の数は、PBS(10μL)のDNAからの水分が皮膚で消えたときに操作可能に決定されます。30秒で100回決定したのは、鍾術で送達された遺伝子から最も一貫した結果が得られていたためです。該当する場合、針は最大6つのターゲットスキンプリック(各1cm×1cm)に再利用できます。鍼の合間に70%エタノールとPBSで針をすすぎます。鈍い場合は新しい針に変更するか、クロスコンタミネーションを避けるために別のプラスミドDNAに交換します。
9. 鍾眼鏡を装着したマウスを温熱パッドに置き、覚醒するまで体温を維持します。
10. 十分な意識を取り戻したマウスをケージに戻します。手記： 鋭く動かしたマウスは、切除していないマウスのケージとは別のケージ(ケージあたり5匹未満)に保管してください。
11. ウォーターボトルを所定の位置に置き、ケージをIVC(個別換気ケージ)ラックに戻します。

>2. 術後のケア

1. 処置後の最初の48時間は、行動の変化(落ち着きのなさ、興奮、摂食障害)や異常な外観(粗い毛並みや猫背の姿勢)などの不快感がないかマウスを注意深く監視します。.

結果

図 1.鍼のイラスト。(A)鍼(36 G x 0.5インチ)は、ハンドルと針先で構成されています。(B)10本の鍼を粘着テープで束ねます。束の長さは、定規(下部パネル)で測定すると約4cmです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュ ハンディニードル	アキュ	36G×0.5	医療機器
ネールTMローション	チャーチ&ドワイト	該当なし	脱毛に使用
シャンドン・ザイラインの代用品	サーモフィッシャーサイエンティフィック	6764506	脱パラフィン
アベルチン(2,2,2-トリブロメタノール)	シグマ・アルドリッチ	T4,840-2	麻酔
2-メチル-2-ブタノール	シグマ・アルドリッチ	152463	アベルチンの溶解用溶媒
QIAGEN® プラスミド MIDI キット	キアゲン	12143	大腸菌からのプラスミドDNAの精製
マウス IL-15/IL-15R コンプレックス ELISA Ready-SET-Go キット	eバイオサイエンス	〒88-7215	IL-15タンパク質の測定