腫瘍特異的CAR-T細胞の抗腫瘍活性を評価するためのin vitroアッセイ

要約

出典:Kueberuwa, G., et al. CD19 CAR T細胞の前臨床評価のための同系マウスB細胞リンパ腫モデル。J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の活性を検証するためのin vitroアッセイを示しています。CD19抗原を発現するB細胞リンパ腫細胞および細胞質ルシフェラーゼをCD19特異的CAR-T細胞と共培養します。CARが腫瘍上のCD19に結合すると、CAR T細胞は腫瘍細胞の細胞毒性を引き起こすサイトカインと毒素を放出します。CAR-T細胞の活性は、腫瘍細胞における放出されたサイトカインとルシフェラーゼ媒介生物発光の減少を定量化することによって評価されます。

プロトコル

1. CAR-T細胞活性のin vitro検証

1. 1 x 10 4細胞の密度でルシフェラーゼ発現の有無にかかわらず、96ウェルU底組織培養プレートの100 μL完全T細胞培地(TCM)/ウェル中の⁴細胞で、同系標的CD19+腫瘍細胞をシードします。
2. 10 μL/ウェルの容量で1 x 10⁴ CD19 CAR T細胞/ウェルを添加すると、エフェクターとターゲット(E:T)の比率が1:1.
   になります 手記： E:T比は、CARコンストラクトおよび標的細胞株ごとに設定する必要があります。
3. T細胞のみおよび腫瘍細胞のみをネガティブコントロールとして使用し、ホルボール-ミリスチン酸-酢酸(PMA)(50 ng/mL)およびイオノマイシン(1 μg/mL)によって刺激されたT細胞をインターフェロン-γ(IFNγ)放出のポジティブコントロールとして使用します。細胞を37°C、5%CO₂で16〜24時間共培養します。
4. 共培養後、プレートを500 x gで5分間遠心分離し、上清を回収してIFNγおよびIL-12p70 ELISAをさらに分析します><。 手記： これは-80°Cで保存できます。
5. 細胞ペレットをルシフェリンを含むPBS100 μLに再懸濁します(最終濃度1.5 mg/mL)。プレートを37°Cで10分間インキュベートします。次に、適切なルミノメーターで各ウェルからのルミネセンスを測定します.
   手記：曝露時間は、細胞株と密度に合わせて最適化する必要があります。代表的な結果を図1aに示します。CAR-T細胞のEx-vivo細胞毒性は、標的抗原を発現する細胞株と共培養することにより、ルシフェリンを発現するように改変することができます。CAR-T細胞が標的細胞を死滅させると、ルシフェリンが放出されるため、ルミノメトリーシグナルの減少は細胞死と相関します。形質導入されていない細胞は、特に長いインキュベーション期間にわたって、標的細胞の生存率に影響を与えることがよくあります。上清中のマウスIFNγおよびIL-12p70の濃度を、メーカーのELISAプロトコルに従って測定します。代表的な結果を(図1bおよび1c)に示します。標的抗原を発現する細胞株との共培養によるCAR-T細胞のEx-vivo活性化は、ELISAを用いて上清内容物を分析することによりアッセイできます。CAR T細胞と標的細胞の比率、および共培養期間の長さは、CARコンストラクト、標的細胞株、および分析物ごとに最適化する必要があります。PMAおよびイオノマイシン治療は、T細胞の品質とそれらの応答能力を確認するためのポジティブコントロールとして使用できます。

結果

図 1.CAR-T細胞活性の検証。αmCD19 CAR T細胞を、ルシフェラーゼ(1 x 10⁴:1 x 10^{x 10 4})を発現するように改変したA20リンパ腫細胞とU底96ウェルプレートで16時間共培養しました。共培養後、細胞をペレット化し、上清を回収した。A)細胞をPBSに再懸濁し、ルミノメトリーを使用して標的細胞の生存率を評価しました。共培養物の上清について、IFNγ(B)およびIL-12(C)の存在について評価しました。CAR-T細胞と標的細胞の比率、および共培養期間の長さは、CARコンストラクトおよび標的細胞株ごとに最適化する必要があります。PMAおよびイオノマイシン治療は、T細胞の品質およびそれらの応答能力細胞を確認するためのポジティブコ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100Xペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(PSG)	ギブコ	10378016
フローサイトメーター - LSR Fortessa x20	BDバイオサイエンス	658222R1
胎児ウシ血清	ギブコ	10270
IL-12 p70 マウスコーティングなしELISAキット	インビトゲン	88-7121-76
イオノマイシンカルシウム塩	シグマ-アルドリッチ	I0634
ルミノメーター - Lumistart Omega	BMGラボテック	415-301
マウスIFN-γ ELISAキット	ダイアクロン	861.050.010
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)	シグマ-アルドリッチ	P8139
RPMI 1640 ミディアム	ロンザ	BE12-167F
XenoLight D-ルシフェリン	パーキン・エルマー	122799

の 型