がん細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞毒性を評価するためのin vitroアッセイ

要約

出典:Baik, C. H., et al. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを実施して、標的がん細胞に対するナチュラルキラー(NK)細胞の細胞毒性を決定する方法を示します。このアッセイは、形成された赤色の生成物の吸光度を測定することにより、がん細胞からの細胞質乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の放出を定量化します。

プロトコル

1. Cytotoxicity Assay: アッセイプロトコール

1. 丸底の培養処理された96ウェルプレートを使用して、表1に示されているようにプレートをセットします。この表は、実験コントロールと3セットのNK実験列を示しています。これは、96ウェルプレートで合計10本のNK実験カラムに拡張できます。
2. アッセイプレートを250 x gで4分間遠心分離し、エフェクターと標的細胞が接触していることを確認します。加湿チャンバーインキュベーターで96ウェルプレートを37°C、5%_CO2で5時間インキュベートし、標的細胞とエフェクター細胞の間の十分な接触、およびエフェクター細胞による標的細胞の溶解を実現します
   手記：ここでプロトコルを一時停止できます。
3. 上清を回収する45分前に、10 μLの10倍溶解液をTarget Cell Maximum LDH Releaseウェル(ウェル1E、1F、1G、1H)に加え、プレートを加湿チャンバーに戻します。
4. インキュベーション時間が完了したら、プレートを250 x gで4分間遠心分離し、マルチチャンネルピペッターを使用して、すべてのウェルから50 μLのアリコートを新鮮な96ウェル平底アッセイプレートに移します。
   手記： 細胞が新鮮なアッセイプレートに移されないように、ウェルの底に触れないでください。培養処理済みプレートを新鮮なアッセイプレートとして使用しないでください。

>2. アッセイ試薬を作成します。

1. アッセイバッファーが室温に達したら、12 mLのアッセイバッファーを1本のSubstrate Mixボトルに加えます。完全に溶解するまで、裏返して静かに振ってください。1本のボトルで2枚の96ウェルプレートに十分です.
   手記：アッセイバッファーは、解凍中は光から保護する必要があります。使用直前に混ぜてください。
2. ステップ4.6から、アッセイプレートのすべてのウェルに50 μLのアッセイ試薬を添加します。プレートをホイルで覆って光から保護し、室温で30分間インキュベートします
   手記：新しく作成したアッセイ試薬は冷凍庫で保存する必要があります。試薬の有効期間は約8週間です。
3. 各ウェルに50 μLのストップ溶液を加えます。Stop Solutionを添加してから1時間以内にプレートを読み取り、490 nm.
   で吸光度を記録します。 代表的なデータを表2に示します。

>表1:アッセイプレートのレイアウト。TCS = 標的細胞の自然発生的LDH放出 (50 μL 標的細胞 + 50 μL 標的細胞培地);TCM = 標的細胞の最大 LDH 放出 (50 μL 標的細胞 + 50μL 標的細胞培地);VCC = 容量補正制御 (50 μL 標的細胞培地 + 50 μL NK 細胞培地);CMB = 培地バックグラウンドコントロール(50 μL標的細胞培地+ 50 μL NK細胞培地);ECSR = エフェクター細胞自然放出 (50 μL NK 細胞 + 50 μL NK 細胞培地);EW = 実験用ウェル (50 μL 標的細胞 + 50 μL NK 細胞)。

の ) ) の ) ) の ) ) の ) )

1	2	3	4	5
TCSの	VCCの	ECSR-1	ECSR-2 (英語	ECSR-3 (英語
TCSの	VCCの	ECSR-1	ECSR-2 (英語	ECSR-3 (英語
TCSの	VCCの	ECSR-1	ECSR-2 (英語	ECSR-3 (英語
TCSの	VCCの	ECSR-1	ECSR-2 (英語	ECSR-3 (英語
ティッカー	CMBの	EW-1	EW-2	EW-3
ティッカー	CMBの	EW-1	EW-2	EW-3
ティッカー	CMBの	EW-1	EW-2	EW-3
ティッカー	CMBの	EW-1	EW-2	EW-3

>表2:NPラットおよびRUPPラットの胎盤NK細胞のYAC1標的細胞に対する細胞毒性を測定するための、カラム1および2の実験コントロールおよび実験ウェルを含むアッセイプレートの生の吸光度データ。

円

1	2	3	4	5
		NPの	ルップ	NPの
0.615	0.484	0.473	0.463	0.471
0.586	0.484	0.458	0.474	0.469
0.61	0.486	0.464	0.459	0.469
0.605	0.55	0.524	0.526	0.543
0.576	0.504	0.519	0.502 0.528	00,528
0.565	0.512	0.515	0.513	0.531
0.563	0.581	0.526	0.508	0.519

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル組織培養プレート	セルトリート	229190	滅菌済み、丸底
セルスクレーパー	漁夫	8100241
Cytotox 96 非放射性細胞毒性アッセイキット	プロメガ	G1780
RPMI(ルプミ)	ギブコ	11875135	1640ミディアム
YAC-1セル	ATCCの	TIB-160