1. ポリカプロラクトントリアクリレート(PCLTA)合成
- 400 Da ポリカプロラクトン (PCL) トリオール 3.2 mL を 50 °C で 200 mL の丸底フラスコに入れ、ガラスバイアルに入れて 90 °C で 3.2 mL
を乾燥させます。
- トリオールを6.4mLのジクロロメタン(DCM)および4.246gのK2CO3とアルゴン下で混合します。.
- 2.72 mLの塩化アクリロイルを27.2 mLのDCMに混合し、フラスコ内の反応混合物に5分間かけて滴下します。.
- 反応混合物をアルミホイルで覆い、アルゴンの下で室温で24時間放置します。
- 24時間後、真空下でBuchner漏斗の濾紙を使用して反応混合物をろ過し、余分な試薬を廃棄します。
- エンドキャップされたポリマーをジエチルエーテルに含有するステップ1.5の濾液を1:3(vol/vol)で沈殿させ、30°Cでロタバップしてジエチルエーテルを除去します。
2. ポリバブルの形成
>注:脱イオン(DI)水にポリマーを注入すると、ポリバブルがバイアルの底に移動し、底が平らになります。ポリバブルの平坦化を避けるために、代わりに10%(wt / vol)カルボキシメチルセルロース(CMC)を使用してガラスバイアルを充填します。
- 脱イオン水に10%(wt/vol)CMC溶液を調製します。
- 1 mLトランスファーピペットを使用して、0.92 mLのガラスバイアルに0.8 mLの10% CMCを満たします。
- 1000 mg/mL の 14 kDa PCL を DCM に混合し、PCLTA を 1:3 (vol/vol) で合成して総容量 200 μL にするか、1000 mg/mL の 5 kDa ポリ (乳酸コグリコール酸) ジアクリレート (PLGADA) をクロロホルムに 200 μL 調製します。
- 2-ヒドロキシ-4′-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン(光開始剤)とポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)の混合物を0.005:1(vol/vol)で混合します。
- 200 μL のポリマー混合物を、内径 0.016 インチの分注ステンレス鋼チューブに接続されたシリンジ ポンプに取り付けられた 1 mL ガラス シリンジにロードします。
- マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前後の動きを制御し、ガラスバイアル内の10%CMCにポリマーを注入してポリバブルを形成します。
- ポリバブルを紫外線(UV)下で254nm波長で60秒間、2W / cm2で硬化させます。
- ポリバブルを液体窒素で瞬間凍結し、0.010 mBarの真空度と-85°Cで一晩凍結乾燥します。
- 鉗子を使用して乾燥したCMCからポリバブルを分離し、ポリバブルをDI水で洗浄して残留CMCを除去します。他のポリマーは、放出速度を変更するためにおそらく変更を加えて使用できることに注意してください。
3. ポリバブル径の変調
- 1 mLトランスファーピペットを使用して、0.92 mLガラスバイアルに10% CMCを満たします。
- PCL/PCLTAを1:3(vol/vol)で1000 mg/mL 14kDa PCLと混合し、PCLTAを合成します。光開始剤とポリマー混合物を0.005:1(vol / vol)で混合します。
- ポリマー混合物を、内径0.016インチのディスペンシングステンレス鋼チューブに接続されたシリンジポンプに取り付けられた1mLガラスシリンジに入れます。
- マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前後の動きを制御し、ガラスバイアル内の10%CMCにポリマーを注入してポリバブルを形成します。
- さまざまな直径のポリバブルを得るには、分注速度を0.0005から1μL / sまで変化させます。
- 直径の異なるポリバブルを含むバイアルの画像を撮ります。
- ImageJを使用してポリバブルの直径を定量化し、バイアルのサイズをスケールとして使用します。
>4. 貨物をポリバブル内にセンタリングする
- K2CO3 を使用した PCL/PCLTA 粘度の変調:
手記：PLGADAの粘度は、1000 mg/mLの5 kDa PLAGDAの粘度が貨物のセンタリングに十分であるため、K2CO3を使用して変更する必要はありません。
- K2CO3(PCLTA反応後に単離したもの)を、0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、60 mg/mLなどのさまざまな濃度でPCLTAに添加します。
- レオメトリーを使用してせん断速度を0から1000 1/sに変更することにより、溶液の動的粘度を測定します。
- 異なる濃度のK2CO3のPCL/PCLTA溶液を使用して形成されたポリバブルの中間にカーゴを手動で注入します(カーゴ混合物の調製についてはステップ4.2を参照)(ステップ4.1.1)。ステップ4.1.1のどの溶液が貨物を途中で保持できるかを観察することにより、K2CO3の最適な濃度を決定します。
- CMCによる貨物のセンタリング(低分子での実現可能性がすでに示されています)
- ローテーターで貨物を5%(wt/vol)CMCと一晩混合して、貨物の粘度を高めます。
- ポリバブルに2μLのカーゴ混合物を手動で注入し、2W / cm2で60秒間、波長254nmでUV硬化を進めます。
- ポリバブルを液体窒素中で30秒間急速凍結し、0.010 mBarの真空度と-85°Cで一晩凍結乾燥します。
- 鉗子を使用して乾燥したCMCからポリバブルを分離し、脱イオン水で洗浄して残留CMCを除去します。
- ポリバブルを半分に切断し、共焦点顕微鏡を使用して半分を画像化し、貨物が中央に配置されていることを確認します(使用する励起波長と発光波長については、ステップ6を参照してください)。
5. 貨物の配合
>注:Polybubble製剤は、低分子、タンパク質、核酸など、さまざまな種類の貨物を収容できます。
- 先行研究に基づき、タンパク質カーゴの場合、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン(PVP)、糖鎖ポリマーなどの賦形剤を使用して、ポリバブル製剤中のタンパク質の安定性を向上させます。
- ステップ2のプロトコルに基づいてポリバブルを形成します。
- 625 μLのHIV gp120/41抗原に17.11 gのトレハロースを加えて抗原溶液を調製します。
- ポリバブルの中央に1μLの抗原溶液を手動で注入します。
- 0日目、7日目、14日目、21日目にポリバブルを開き、励起波長497 nmおよび発光波長520 nmの抗原の蛍光を記録します。
- 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗原の機能を判断し、ブロッキングバッファーとして5%無脂肪牛乳を使用します。
6. 貨物の解放
>注:カーゴタイプとして小分子または抗原を使用できます
- 低分子
ポリ- バブルを400 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に中心化アクリフラビンとインキュベートし、PLGADAポリバブルの場合は37 °C、50 °C、70 °C、PCL/PCLTAポリバブルの場合は37 °C、50 °C、70 °Cでインキュベートします。
手記：体温以上のテストを推奨する理由は、a)PCLおよびPLGA内の金ナノロッド(AuNR)をレーザーで照射しながら、ポリバブルが到達する温度(50°C)をシミュレートするためです。b)PCL(50°C、70°C)の分解プロセスを加速します。
- 各時点で、上清を回収し、400 μLの新鮮なPBSと交換します。
- プレートリーダーを使用して、収集した上清中の蛍光強度を定量化します
手記：アクリフラビンには416 nm / 514 nmのex / emを使用します。
- 抗原
ポリ- バブルを400 μLのPBS中、37 °C、50 °C(PLGADAポリバブルの場合)、37 °C、50 °C(PCL/PCLTAポリバブルの場合)で、中心に形成されたウシアルブミン血清(BSA)-488とポリバブルをインキュベートします。
- 各時点で、上清を回収し、400 μLの新鮮なPBSと交換します。
- プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。BSA-488.
には497 nm/520 nmのex/emを使用
手記：PCL/PCLTAポリバブルの70°Cでの放出試験は、抗原が極端な温度にさらされるのを避けるために実施しないでください。