乳酸桿菌無細胞上清の抗がん効果評価法

要約

出典:Lee, J., et al. Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオは、ラクトバチルス無細胞上清(LCFS)の抗がん効果を研究するためのin vitroアッセイを示しています。結腸直腸がんスフェロイドをさまざまな用量のLCFSに曝露すると、LCFS中の細菌代謝物との相互作用により、がん細胞のアポトーシスが誘導され、スフェロイド構造が破壊され、用量依存的に細胞死が引き起こされます。

プロトコル

1. 細菌の細胞培養と乳酸菌無細胞上清(LCFS)の調製

注:ステップ1.2〜1.9は嫌気性チャンバーで行われます。

1. De Man–Rogosa–Sharpe(MRS)寒天プレートとL-システインを含むブロスを調製し、オートクレーブ滅菌します。
2. MRS寒天プレートを、37°Cに維持された_H2嫌気性チャンバーで20ppmの酸素で事前にインキュベートします。
3. ラクトバチルス菌菌を解凍し、寒天プレートに細菌培養液を接種します(図1A(i))。
4. 単一の細菌コロニーが得られるまで、37°Cおよび20ppm酸素の_H2嫌気性チャンバーで2〜3日間細菌をインキュベー
トします。
5. Hungate型アネロビック培養チューブを洗浄して乾燥させます。培養チューブを121°Cで15分間オートクレーブします。
6. 次に、チューブを37°Cおよび20ppmの酸素で_H2嫌気性チャンバーでインキュベートし、酸素を除去します。
7. 2〜3mLのMRSブロスをチューブに入れます。チューブをブチルゴムストッパーで密封し、キャップをねじ込みます。
8. ループ付きの単一のコロニーを取得し、500 μLの1x PBSを入れた1.5 mL培養チューブに入れます。(図1A(ii))。
9. 1mLシリンジ(図1A(iii))を使用してコロニーを懸濁します。これを行うには、1 mLシリンジの針をチューブ蓋の中央に挿入し、懸濁したコロニーを吸引してから、MRSブロス培地に再懸濁します。(図1A(iv))。
10. MRSブロス培地をシェーカーインキュベーターで2日間インキュベートします(37°C、5%CO₂、200rpm)。
11. 分光光度計を使用して光学密度(OD)を測定し、OD₆₂₀の吸光度が2.0に達するまで細菌の成長曲線を監視します。
12. 1,000 x gで15分間遠心分離することにより、細菌ペレットと馴化培地を分離し、収集した細菌ペレットを1x PBSで洗浄し、10%ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640の4 mLに再懸濁します。培地に抗生物質を含めないでください。
13. バクテリアペレットをRPMIで保持し、シェーカーインキュベーターで5%_CO2を100rpmの速度で37°Cで4時間インキュベー
トします。
14. プロバイオティクス上清の調製には、1000 x gの遠心分離により細菌ペレットを4°Cで15分間除去します。回収した上清を0.22 μmフィルターを使用して滅菌ろ過し、使用するまで-80°Cで保存します。

2. 回転楕円体の生成

1. 結腸直腸癌細胞株の調製
   1. DLD-1、HT-29、およびWiDr細胞株を単層として70〜80%のコンフルエントになるまで増殖させ、プレートを5% CO₂インキュベーター(増殖培地:10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI)で37°Cでインキュベートします。
   2. 100 mmシャーレで増殖した細胞の場合は、1x PBSの4 mLでプレートを2回洗浄します。0.25%トリプシン-EDTAを1 mL添加し、ペトリ皿を5% CO₂インキュベーターで37°Cで2分間インキュベートして細胞を解離します。
   3. インキュベーション後、顕微鏡で細胞の解離を確認し、5 mLの増殖培地でトリプシン-EDTAを中和します。
   4. 解離した細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、300 x gで3分間遠心分離します。
   5. 上清を捨て、3 mLの増殖培地で穏やかに再懸濁します。
   6. トリパンブルーで細胞をカウントし、血球計算盤を使用して生存細胞を決定します。(図1B(i))
2. スフェロイドの形成
   1. 15 mLのコニカルチューブで、細胞を2.1.5に希釈して、1 - 2 x 10⁵細胞/mLを得ます(図1B(ii))。
   2. 最終濃度の0.6%メチルセルロースを細胞懸濁液に加え、希釈した細胞を滅菌リザーバーに移します.
      注:各細胞株について、必要なメチルセルロースの量を滴定し、それに応じて決定する必要があります。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、超低アタッチメントの96ウェル丸底マイクロプレートの各ウェルに200 μLの細胞を分注します。(図1B(iii))
   4. プレートを5%_CO2インキュベーターで37°Cで24〜36時間インキュベー
   トします。
   5. 24〜36時間後、光学顕微鏡でプレートを観察し、スフェロイドの形成を確認します。

3. LCFSによる3次元大腸がん細胞の治療

1. ステップ 2 と 3 の説明に従ってスフェロイドを生成します。
2. LCFS処理を行う前に、凍結したLCFSを室温(RT)で10〜20分間解凍してください。
3. LCFSストック溶液を成長培地に接種します。増殖培地中で25%、12.5%、および6%に段階的に希釈します(すなわち、25%LCFS = 150 μLの成長培地+ 50 μLのLCFS)。
4. スフェロイドを含む細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、200 μLピペットを使用して各ウェルからできるだけ多くの増殖培地を取り出します。
5. LCFSを含む増殖培地を細胞に添加し、5% CO₂インキュベーターで37°Cで24〜48時間
   インキュベートします。 手記： 使用する容量は、プレートのサイズによって次のように異なります:6ウェル細胞培養プレートの場合は2 mL;200 μL (96ウェル細胞培養プレート用)。

結果

図1:スフェロイド形成とLCFS調製の概略図。

(A) LCFS生成プロトコルの概略図画像は(i-iv) (B) メチルセルロースを介したスフェロイド形成の概略図は(i-iii)で示されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Applied Biosystems MicroAmp 光学接着フィルム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4311971	100カバー
Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock 微量遠心チューブ、ポリプロピレン、透明、非滅菌、500 チューブ/パック、10 パック/ケース	コーニング	SCT-200-Cの	500チューブ/パック、10パック/ケース
BD Difco バクト寒天	BDの	214010	500グラム
BD Difco 乳酸菌 MRS ブロス	BDの	DF0881-17-5	500グラム
Corning リン酸緩衝生理食塩水、1X カルシウムおよびマグネシウムなし、PH 7.4 ± 0.1	コーニング	21-040-履歴書	500ミリリットル
Falcon 5 mL丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ付き	コーニング	352235	25 /パック、500 /ケース
ウシ胎児血清、認定、米国原産	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16000044	500ミリリットル
ラクトバチルス・ファーメンタム	タイプカルチャーのための韓国語コレクション	KCTC 3112
L-システイン塩酸塩一水和物	シグマ・アルドリッチ	C6852-25G	25グラム
メチルセルロース(3500-5600mPa·s、20°Cで水中2%)	TCIの	M0185	500グラム
MicroAmp Fast Optical 96ウェルリアクションプレート(バーコード付き)、0.1 mL	応用バイオシステム	4346906	20プレート
Millex-GS シリンジフィルターユニット、0.22 μm、混合セルロースエステル、33 mm、エチレンオキシド滅菌済み	ミリポア	SLGS033SB	250
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	100ミリリットル
RPMI-1640	ギブコ	11875-119	500ミリリットル
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200056	100ミリリットル
材料・設備・ソフトウェア
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー	ヘラセル150i
コニカルチューブ15 ml	SPLの	50015
コニカルチューブ50 ml	SPLの	50050
Corning Costar 超低アタッチメントマルチウェルプレート	シグマ・アルドリッチ	CLS7007
Corning Costar 超低アタッチメントマルチウェルプレート	シグマ・アルドリッチ	CLS3471
Costar 50 mL 試薬リザーバー、5/袋、滅菌済み	共演者	4870
Countess Cell Counting Chamber スライド	サーモフィッシャー	C10228
Countess II FL 自動セルカウンター	インビトゲン	AMQAF1000
EnSpire マルチモード リーダー	パーキン・エルマー		エンスパイア2300
Eppendorf Research Plus マルチチャンネルピペット、8チャンネル	エッペンドルフ	3122000051
インキュベートシェーカー	ラボコンパニオン	SIF-6000Rの
マルチゲージVer.3.0、	富士フイルム		東京、日本
光学密度(OD)LAMBDA UV/Vis分光光度計	パーキン・エルマー		ウォルサム、マサチューセッツ州、米国
位相差顕微鏡	オリンポス		東京、日本
SPL微量遠心チューブ1.5mL	SPLの	60015
SPLマルチチャンネルリザーバー、12-Chs、PS、滅菌済み	SPLの	21012
Vibra-Cell 超音波液体プロセッサー	SONICS-バイブラセル	VC 505	500ワットの超音波プロセッサ
ビニール嫌気性チャンバー	COY LAB製品

名 の 名 年