ヒト肝細胞と免疫細胞を用いたヒト化マウスモデルの開発

Abstract

出典:Dagur, R. S. et al., HIV関連肝病因のためのデュアルヒト化TK-NOGマウスモデルの確立。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、ヒト免疫系と肝細胞を持つデュアルヒト化マウスモデルを生成する方法を示します。これは、ヒト肝細胞、造血幹細胞、造血幹細胞および前駆細胞をトランスジェニック免疫不全マウスに脾腔内注射により移植し、肝細胞の生着とヒト免疫細胞の発達につながるというものです。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 臍帯血の処理とヒト造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)の単離

1. プロトコールのすべてのステップを、層流キャビネット内の無菌条件下で実行します。
2. ヘパリンチューブに採取した臍帯血(CB)を採取し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて最大35mLにします。図1に示すように、リンパ球分離培地(LSM)の上にサンプルを重ね、層状CBを使用してLSMを400 x gで4°Cで35分間遠心分離します。ブレーキなし
   手記：界面での混合を避けるために、血液を慎重かつ穏やかに希釈します。
3. 上部のLSMとプラズマ層を慎重に取り外し、トランスファーピペットを使用してホワイトバフィーコートインターフェースを新しいチューブに移します。
4. バフィーコートを30〜40 mLの氷冷バッファー(PBS + 0.5%ウシ血清アルブミン[BSA]+ 2 mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA])に再懸濁します。.ピペットを使用して、20 μLの細胞懸濁液と20 μLの0.4%トリパンブルーを組み合わせ、10 μLの混合物を計数スライドの2つのチャンバーのいずれかの外側の開口部にピペットで移し、スライドを自動セルカウンターに挿入して細胞をカウントします。
   手記： すべてのステップで氷冷バッファーを使用すると、細胞の生存状態を保つのに役立ちます。
5. 細胞を300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を慎重に吸引します。次に、300 μLの氷冷バッファーを加えます。
6. 100 μLのヒトFc受容体ブロッキング試薬と100 μLのモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体標識マイクロビーズを最大1 x 10⁸細胞に添加します(材料表を参照)。4°Cで30分間インキュベートし、10 mLの氷冷バッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gで4°Cで10分間遠心分離します
   注:1 x 10⁸セルを超える場合は、セル番号に従ってこれをスケールアップします。
7. 上清を慎重に除去し、ペレットを500 μLのバッファーに再懸濁し、磁気分離ステップを進めてHSPCを濃縮します。
8. ポジティブセレクションLSカラム(材料表を参照)を磁気活性化細胞ソーティングフィールドに配置し、3 mLのバッファーで通過させます。
9. ヒトCD34+に結合したマイクロビーズをサンプルに捕捉し、重力の影響下で収集チューブに流入できるLSカラムにサンプルをロードします。
10. カラムをバッファーで3回洗浄し、CD34^-細胞画分の同じコレクションチューブに溶出物を収集します。
11. カラムに 5 mL のバッファーを注入して、CD34⁺ 細胞を新しいコレクションチューブに溶出します。この手順を繰り返して、>90%の純度を達成します。
12. 血球計算盤でトリパンブルー色素を使用して溶出したCD34⁺細胞をカウントします。カウント後、CD34⁺細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
13. CD34⁺細胞を25μLのPBSに再懸濁してすぐに移植に使用する注射液、または凍結培地(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地[RPMI 1640培地]+50%ウシ胎児血清（FBS）+10%ジメチルスルホキシド[DMSO])で細胞を1〜200万mLの濃度で凍結保存して、さらに移植に使用します><。 手記： 移植に使用する前に、必ず生存可能な細胞を再カウントしてください。
14. CD34⁺溶出液の純度を確認するには、懸濁液50 μLを取り出し、10 μLのフィコエリトリンまたはPE標識抗ヒトCD34抗体と4°Cで30分間インキュベートします。抗体インキュベーション後、染色した細胞をPBSで洗浄し、100 μLのPBSに再懸濁した後、フローサイトメトリーに進みます。抗体を含まない細胞のチューブを追加して、フローサイトメーターのゲートを設計します。
15. 取得後、前方散乱図(FSC)と側方散乱光(SSC)プロットで関心領域を選択してデータを解析し、続いてFSC面積プロットとFSC高さプロットで単一セルをゲーティングします。PEチャネルおよびSSCエリアプロットの単一細胞上のCD34陽性細胞をゲートします。

2. 移植用ヒト肝細胞(HEPs)の調製

1. 凍結保存された肝細胞を液体窒素から取り出し、バイアルを水浴に素早く沈め、約90〜120秒間解凍します。
2. バイアルキャップを取り外し、解凍した肝細胞を温めた解凍培地の50mLコニカルチューブに注ぎます。
3. 50mLチューブを手で数秒間揺さぶって細胞を懸濁します
   手記： チューブを渦巻きにしないでください。
4. 細胞を100 x gで室温で8分間ペレット化します。ペレット化した細胞をPBSで0.1% BSAで洗浄し、新鮮または解凍したHSPC(比率10:1)とPBSでプールし、最終容量80 μL/マウスにします。

3. ヒトHSPCおよび肝細胞移植のための動物の取り扱い、スクリーニング、ジェノタイピング、および治療

1. 動物の取り扱い
   1. 重度の免疫不全の結果として、TK-NOGマウスを無菌条件下で繁殖、飼育、および取り扱います。
   2. 病原性微生物の感染を防ぐために、常に白衣、手袋、靴カバー、フェイスマスクを着用してください。
   3. 手術には滅菌手袋と器具を使用し、手術中は動物を無菌的に取り扱います。
2. 実験用TK-NOGマウスの選抜
   1. 雌のTK-NOGマウスを雄の非TK-NOG同腹仔と交配させることによりTK-NOG系統のコロニーを維持し、遺伝子型決定によりトランスジェニック仔を選択する
      手記： ジェノタイピング(ステップ3.3を参照)を行い、離乳時の新生児の雄および雌マウスにおける導入遺伝子の有無を判定します。
   2. 移植には、GCVを介したHSV-TK導入遺伝子発現肝細胞の枯渇に対する感度が高いため、6〜8週齢の男性を選択します。
   3. 離乳時や手術時にマウスに耳標を付けて、識別を容易にします。動物の体重と健康状態を書き留めます。
3. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いたHSV-TK導入遺伝子の存在のジェノタイピング
   1. 離乳時(通常は生後3〜4週齢)にジェノタイピングを行います。ジェノタイピングには、マウスの耳の一部を層流生物学的安全キャビネットで切断して無菌性を維持し、ゲノムDNA単離キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
   2. 1 μL のフォワードプライマー 5'-CCATGCACGTCTTTATTCCTGG-3'、1 μL のリバースプライマー 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3'、0.5 μL の FAM プローブ 5'-FAM-AATCGCCCCCCCGGCTGC-MGB-3' を添加することにより、ヒトアルブミンプロモーターの制御下で HSV-TK 導入遺伝子をスクリーニングするために、20 μL 反応混合物でイヤーピースから抽出したゲノム DNA を増幅します。 10 μL のマスターミックスをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 装置で。
   3. リアルタイム PCR 設定を次のように設定します: 60 °C で 30 秒 (プレリードステージ)、95 °C で 10 分間 (ホールドステージ)、95 °C で 15 秒と 60 °C で 1 分間の 40 サイクル (PCR ステージ)、60 °C で 30 秒 (ポストリードステージ)
      手記： 閾値(Ct)が22未満のサイクルは、HSV-TK導入遺伝子に対して陽性と見なされます。
4. ガンシクロビルとトレオスルファンを使用した治療
   1. 27 G針を使用して、TK-NOGマウスに腹腔内GCV注射(6 mg / kg)を7日目と5日目に1日2回、100 μLの生理食塩水で注射し、マウスのトランスジェニック実質細胞を枯渇させます(図2の実験戦略を参照)。
   2. 手術の 3 日目、2 日目、および 1 日目に、27 G の針を使用して、100 μL の生理食塩水に骨髄破壊的でない腹腔内用量のトレオスルファン (1.5 g/kg/日) を投与したマウスをプレコンディ
   ショニングします。
   3. 手術の1日前に、顎下静脈から5mmのランセットで刺して2〜3滴(~100μL)の血液を採取し、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)アッセイのために遠心分離(1,500 x g、4°Cで10分間)して血清を分離し、肝障害の程度を評価します。
5. 手術の準備
   1. 手術前に、切開部位(腹膜壁の左側)を囲むマウスの毛皮をバリカンで剃ります。
   2. マウス麻酔器を使用して、誘導チャンバーで酸素流量を1 L / minに、イソフルラン流量を3%〜5%に調整します。麻酔のために、一度に1匹のマウスを誘導室に入れます。
   3. 滅菌延長チューブ(保持容量550μLの懸濁液、仕様については材料表を参照)の一方の端を30Gの針に取り付け、もう一方の端を1mLのシリンジに取り付けます。
   4. シリンジにプールされたHEPおよびHSPCの懸濁液(80 μL/マウス)を充填し(セクション2を参照)、シリンジを反復分注ピペットのノッチに取り付け、各プレスで10 μLを分注するようにディスペンサーを調整します。
   5. マウスが麻酔されたら(通常は3〜4分後)、イソフルランの流れを鼻円錐に切り替え、イソフルランの流量を2%〜3%に減らします。
6. マウスにおけるヒトHSPCおよび肝細胞の脾腔内移植
   1. すべての手術ステップは、無菌条件下で層流キャビネット内で行います。
   2. 作業面に清潔な滅菌ドレープを敷き、切開する前に、各マウスの体の左側を10%ポビドンヨードと70%イソプロピルアルコールでこすります。
   3. 腹壁の左側の皮膚、筋肉、腹膜に小さな切開(長さ1~1.5cm、深さ5mm)をヴァンナタイプのハサミで行い、胸郭の下端から約5mm下の腹腔に入ります。
   4. 脾臓の位置を特定し、鉗子で手術部位に少し引っ張って簡単にアクセスできるようにし、30Gの針を脾臓の下極に挿入します。
   5. 分注ピペットのプランジャーのロックを解除し、一度に10μLの容量を分注します。脾臓あたり60〜80μLの制限で。針をゆっくりと引っ込め、結紮アプライヤーを使用して結紮クリップで脾臓をクリップします。
   6. 滅菌PBSで濡らした綿の先端のアプリケーターで脾臓を体腔に押し戻します。
   7. 吸収性縫合糸の中断縫合パターン(連続的ではない)を使用して、腹壁の筋肉層を閉じます。非吸収性縫合糸を使用した断続縫合パターンで皮膚の閉鎖を達成します。

Results

図1:臍帯血からのCD34⁺細胞の濃縮の概略図。(A)臍帯血をリンパ球分離培地(LSM)上に重ね、遠心分離してバフィーコートを分離します。(B)LSカラムを磁気スタンドに置き、BSAバッファーですすいでから、バフィーコートを追加します。CD34陽性の細胞はカラムにトラップされ、CD34細胞は別々のチューブで溶出されます。カラムレジンに閉じ込めたCD34⁺細胞をプランジャーで沈め、細胞を新しいチューブに集めます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
27G1/2インチ針	BDバイオサイエンス	305109
30G1/2インチ針	BDバイオサイエンス	305106
5 mLポリスチレン丸底チューブ、12 x 75 mmスタイル	コーニング	352054
BD 1 mL ツベルクリンシリンジ 針なし	BDバイオサイエンス	309659
BD FACSアレイバイオアナライザー	BDバイオサイエンス		溶出CD34+細胞の純度チェックに
BD FACSアレイソフトウェア	BDバイオサイエンス		FACSアレイ上で獲得したCD34+細胞を解析するソフトウェア
BD FACSライジングソリューション	BDバイオサイエンス	349202	赤血球を溶解するには
BD LSR II	BDバイオサイエンス		フローサイトメトリーサンプルの収集用機器
BDバキュテナープラスチック採血チューブ	BDバイオサイエンス	BD 367874	臍帯血を採取するには
ウシ血清アルブミン	シグマアルドリッチ	A9576の
CD34 MicroBead キット、ヒト	ミルテニーバイオテック	〒130-046-702	CD34+ HSPCのアイソレーション用
CD34-PE、ヒト	ミルテニーバイオテック	〒130-081-002	溶出したCD34+細胞の純度チェックに用いる抗体
セルカウンティングスライド	バイオ・ラッド	1450015
ChargeSwitch gDNAミニティッシュキット	サーモフィッシャー科学	CS11204	イヤーピースからのゲノムDNAの抽出用
綿チップのアプリケーター	マッケソン	24-106-2S
DMSO(ジメチルスルホキシド)	シグマアルドリッチ	D2650-5X5ML
エクステンションセット マイクロボアスライドクランプ 固定オス ルアーロック。L:60インチL:152cm PV:0.55 mL 流体経路滅菌	BDバイオサイエンス	30914	分注ピペットに取り付けられ、HSPCおよびHEPサスペンドをロードします
FACS Divaバージョン6	BDバイオサイエンス		サンプルの採取に必要なフローサイトメーターソフトウェア
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	10438026
FLOWJO解析ソフトウェア v10.2	FLOWJO合同会社		フローサイトメトリー解析ソフトウェア
ガンシクロビル	APPファーマシューティカルズ株式会社	315110	Prescripition薬
Greiner MiniCollect EDTAチューブ	グライナーバイオワン	450475
肝細胞解凍培地	トライアングル・リサーチ・ラボ	MCHT50
Horizon オープン ライゲーティング クリップ アプライヤー	テレフレックス	537061	ライゲーションクリップを保持するには
ヒト肝細胞	トライアングル・リサーチ・ラボ	ハップ1	凍結保存されたヒト肝細胞、誘導適格
アイリスハサミ、ストレート	テッド・ペラ社	13295
刃針	メディポイント	アキノキリンソウ5 mm
LS カラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-401	CD34+マイクロビーズの捕捉に使用(ポジティブセレクション)
リンパ球分離培地(LSM)	MPバイオメディカル	50494	末梢血からのリンパ球の分離
MACSマルチスタンド	ミルテニーバイオテック	〒130-042-303	Qudro MACSセパレーターとLSカラムを保持
McPherson-Vannas マイクロ解剖スプリングハサミ	ロボズ手術器具株式会社	RS-5605	脾臓を露出させるために皮膚を切開するために使用されます
マイクロ解剖鉗子	ロボズ手術器具株式会社	RS-5157	腹腔から脾臓を保持して引き出す
マウスCD45-FITC	BDバイオサイエンス	553080	マウス固有
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)	ハイクロン	SH30256.02
Qudro MACSセパレーター	ミルテニーバイオテック	〒130-090-976	LSカラムを4本保持
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11875093
StepOne PlusリアルタイムPCR	応用バイオシステム		ジェノタイピングに使用される機器
ステッパーシリーズ反復分注ピペット1ml	ダイマックス株式会社	T15469	HSPCおよびHEPのsupensionを制御された方法で分配するために使用されます
TaqMan 遺伝子発現マスターミックス	サーモフィッシャー科学	4369016
TC20 自動セルカウンター	バイオ・ラッド	1450102
TK-NOGマウス			提供:一般社団法人 実験動物中央研究所(CIEA、伊藤 守博士、末水 浩博士)
トレオスルファン	メダックGmbH		ヨアヒム・バウムガルト博士(medac GmbH)提供
トリパンブルー	バイオ・ラッド	1450022
バンナス型マイクロハサミ ストレート 80mm L	テッド・ペラ社	1346	脾臓を露出させるために皮膚を切開するために使用されます
ウェックヘモクリップ 伝統的なチタン製ライゲーションクリップ	縫合糸	523700	注射後の脾臓を結紮する