ゼブラフィッシュ胚における緑膿菌感染に対するファージ療法

要約

出典:Cafora, M., et al., A. 嚢胞性ゼブラフィッシュ胚における緑膿菌感染に対抗するためのファージ療法の適用 J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、嚢胞性線維症ゼブラフィッシュの胚における緑膿菌感染を標的としたファージ療法技術を示しています。ファージ療法は、細菌に感染したCFゼブラフィッシュ胚の細菌負荷を効果的に減少させ、炎症誘発性免疫応答を緩和し、CF胚の致死率を低下させます。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュ胚への細菌とファージのカクテルのマイクロインジェクション

>注:全身感染を行うには、胚は通常26 hpf後に始まる血液循環を持っていなければなりません。

1. 26 hpf後、プロナーゼ粉末をE3培地に2 mg / mLの濃度で溶解することにより調製したプロナーゼ溶液で胚をデコレーションします。胚をそっとピペットで動かして絨毛膜を壊します。プロナーゼ/ E3培地を廃棄し、新鮮なE3で皿を数回すすぎ、すべてのプロナーゼを取り除きます。
2. 注射の約5分前に、トリカインを含むE3培地でゼブラフィッシュの胚を麻酔します。
3. 麻酔をかけた胚をステップ1で準備したトラックにピペットで移します。細いゲルローディングチップを使用して、胚を横向きの位置に並べます。
4. マイクロインジェクション針に約5μLの緑膿菌製剤をロードします。
5. 針をキュビエの管の始点まで背側に挿入し、そこで針が卵黄嚢に広がり始めます。1〜3 nLのボリュームを注入し、ボリュームがダクト内で直接膨張して循環に入ることを確認します。
6. 約50個の胚を注入した後、100μLの滅菌PBSを入れた1.5mLの遠心チューブに細菌を1滴注入し、注入量が同じままであるかどうかを確認します。接種物をLB寒天培地(表1を参照)に37°Cで一晩プレートし、CFUを評価します。
7. マイクロインした胚を、新鮮なE3培地+PTU(表1)を入れた2つの清浄なペトリ皿に移し、28°Cでインキュベートします。
8. 選択した2つの時点で:細菌注射の30分後または3時間後に、細菌注入された胚が入ったペトリ皿の1つをインキュベーターから取り出し、ファージカクテル注射の6.3で説明されているようにトラックに整列させます。
9. マイクロインジェクション針に約5μLのファージカクテル(PAO1株に感染する4つのファージの混合物)を細いゲルローディングチップでロードし、マイクロインジェクターに固定します。
10. 以前に細菌を注入した胚のCuvierの管にファージカクテルを注入します。
11. マイクロインインジェクションした胚を、新鮮なE3培地+PTUを入れた2つの清潔なペトリ皿に移し、28°Cでインキュベートします。

>表1:溶液の調製

ソリューション	準備
麻酔薬ストック溶液25X	蒸留H2O中の4 mg / mLトリカイン。
麻酔用ワーキングソリューション1X	蒸留H2Oでトリカインストック溶液25倍調製物で希釈し、蒸留H2Oの1倍濃度(0.16 mg / mL)トリカインに到達します。
CsCl d=1.3	20.49 g 50 mL TN 中
CsCl d=1.4	50mL TNに20.28g
CsCl d=1.5	50mLTN中に34.13g
CsCl d=1.6	TN50 mLに41.2 g
ゼブラフィッシュ胚用E3胚培地	1 L 1of E3 (50X ストックを蒸留 H2O で希釈) + 200 μl の 0.05% メチルブルー .RTで保管してください。
E3胚培地ストック溶液(50X)	蒸留H2O5 L中にNaCl 73.0 g、KCl 3.15 g、CaCl2 9.15 g、MgSO4 9.95 gを含有。RTで保管してください。
LB寒天	10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母エキス、5 g/L NaCl、10 g/L寒天
LBブロス	1Lの場合:950 mL H2O、10 gトリプトン、10 gナトリウム、5 g酵母抽出物
PBSTの	PBS 1X + Triton X 1%
生理液	0.9%NaCl
色素沈着防止ストック溶液10X	0.3 mg/mL ゼブラフィッシュ胚用E3胚培地中のフェニルチオ尿素(PTU)粉末
プロナーゼストック溶液5X	ゼブラフィッシュ胚用E3胚培地中の5 mg/mLプロナーゼ粉末
TNバッファ	10 mM Tris HCl pH 8.0、150 mM NaCl

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バクト寒天	BDの	214010
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水PBS	シグマ・アルドリッチ	D8537
3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸	シグマ・アルドリッチ	〒886-86-2	一般名トリカイン
Femtojetマイクロマニピュレーター	エッペンドルフ	5247
マイクロインジェクション針	ハーバードの装置
N-フェニルチオ尿素>=98%	アルドリッチ-P7629	103*85-5
プロナーゼ	シグマ・アルドリッチ	9036-06-0
Z-MOLDSマイクロインジェクション	ワードプレシジョン機器

名