ラットの切片アキレス腱への多血小板血漿注入

要約

出典:Greimers, L., et al. Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description. J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、ラットの切片化されたアキレス腱に多血小板血漿(PRP)を注入する技術を示しています。レシピエントラットのアキレス腱から小さなセグメントを切除し、その部位を縫合し、ラットを回復させます。同時に、ドナーラットから全血を採取し、遠心分離してPRPを取得し、これを活性化してレシピエントラットの縫合部位に注入して腱修復を誘導します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の調理法

1. 体重320〜450 gの2か月齢の雄Sprague-Dawleyラット132匹(実験用ラット120匹、採血用ラット12匹、図1)を使用します。各グループに対して15匹のラットは、0.8の検出力(指定された効果が存在する場合、統計的有意性を見つける可能性が80%)には十分でした。
2. すべてのラットを従来の施設の隔離条件下で古典的なケージに収容し、交換ステーションを備えています。IVC(個別換気ケージ)ラックで繁殖を開始し、SPF(Specific Pathogen-Free)ラットを特別に購入します。
3. 次のハウジング条件を使用してください:温度範囲19-24°C、相対湿度:40-60%、換気:空気更新頻度:1時間あたり10-15、明暗サイクル:12時間-12時間。
4. すべてのケージ機器を滅菌し、照射された寝具を使用してください。滅菌済みの段ボールトレイとタオルをケージ内に配置することにより、ケージ濃縮を体系的に実施します。
5. 制限された条件下でゾーンへのアクセスを許可します:新しい白衣、マスク、手袋、履物、入り口のヘアボンネット。
6. 従来の施設に対するフェラサの推奨事項に従って、汚れた寝具に収容されたセンチネル動物のコロニーの健康モニタリングを毎年実施します。ケージごとに4〜5匹の動物を適切な照射食で飼育し、酸性水を自由に供給します。毎日監視します。
7. 手術の2時間前に、トップケージをろ過する外科的介入のために選択されたラットを手術室に移します。

2. 外科手術

1. 手術器具を準備します:細かいはさみ、クランプ、止血クランプ2つ、ニードルホルダー。すべての手順では、手袋、マスク、フード、白衣を着用してください。
2. ラットをランダムに2つのグループ(PRPと生理食塩水)に分けます。
3. ネズミをケージから取り出し、体重を量ります。番号付きの耳タグを使用して、ネズミを識別します。目の乾燥を防ぐために、角膜に水滴を置きます。
4. キシラジン(体重10 mg / kg)とケタミン(体重80 mg / kg)でラットを腹腔内に麻酔します。.動物を心肺モニタリング下に置き、麻酔を確認し、眼の反射を確認します。
5. 鎮痛剤として、50μLのブプレノルフィンを首の領域に皮下注射します(8〜12時間ごとに0.01〜0.05mg / kg)。
6. 電気シェーバーで左後肢を剃り、イソベタジン/アルコール(1:10に希釈)溶液を交互に3回入れて消毒し、ラットを温かいパッド(20°C)の解剖顕微鏡下に置きます。ラットを外側褥瘡に置き、手術する脚を上の位置に置きます。外科用鉗子で足を持ちます。
7. はさみを使用して、左アキレス腱の周囲の皮膚に小さな横切開(20〜25 mm)を行い、細いハサミを使用して筋膜を解剖してアキレス腱複合体を露出させます(図2a)。
8. ハサミで足底筋腱を取り外します(図2b)。
9. アキレス腱を踵骨挿入部から近位5mm横方向に切断し、ハサミで5mmの長い部分を取り除きます。腱を縫合しないでください(図2c、2d)。
10. 筋膜と皮膚を再吸収性糸で縫合し、オーバージェット縫合(連続縫合)を行います。モノフィラメント縫合糸は、皮膚から外科的切開部へのウィッキングを防ぐこともできます。
11. 目が覚めるまでラットを加熱ランプの下に置いてから、ラットをケージ(58 x 38 cm)に戻します(注:固定は課されません)。

3. PRPの準備

1. 腹腔内注射により、キシラジン(体重10 mg / kg)とケタミン(体重80 mg / kg)でドナーラットに麻酔をかけます。.PRP注射は、術後2時間で再麻酔薬なしで行われます。
2. 鎮痛剤として50μLのブプレノルフィンを皮下注射します。.
3. 心臓穿刺により全血(ラットあたり20 mL、最終出血)を、3.2%緩衝クエン酸ナトリウム(0.109 M、抗凝固剤)を含む滅菌チューブに収集します。.次に、心臓内注射によりラットを安楽死させます。
4. PRPを得るには、血液を150 x g、室温で10分間遠心分離します。この最初の低速遠心分離ステップでは、総体積の約80〜90%を占める赤血球(RBC)からなる下段と、多血小板血漿(PRP)(通常は血液サンプルの10〜20%)で構成される上段の2つの異なる相が得られます。
5. プラスチックトランスファーピペットを使用して、PRP(上相)を二次プラスチックチューブに集めます。PRPと赤血球の間の界面は非常に緩いため、界面に近づきすぎないでください。適切に取り扱われた場合、PRP中の汚染RBCは0.05 x 10³細胞/μL未満であるべきです。
6. 収集されたPRPの量を決定し、血液分析装置で血小板数を測定します。これらの値は、次のステップで血小板濃度を調整するための計算に必要です。血球数は、RBCおよびWBCによる潜在的な汚染を評価するのにも役立ちます。この段階でのPRPの血小板濃度は通常1〜1.5 x10⁶ /μLです。
7. PRPの2回目の遠心分離を1,000 x gおよび室温で10分間行います。この高速遠心分離ステップにより、緩い血小板ペレットと自家血小板乏血漿(PPP)の上清が得られます。ステップ3.6で決定した値を使用して、PRPを濃縮し、最終濃度2.5 x10⁶/μLに達するために廃棄される上清の量を計算します。
8. プラスチック移送ピペットを使用して、上清(PPP)を二次プラスチックチューブに静かに集め、ステップ3.7で計算した最終容量の約3分の2を残します。ペレットが緩んでいると、PPPを廃棄するとかなりの量の血小板が失われ、目的の濃度が低下する可能性があります。
9. 血小板ペレットを残りの上清とともに、穏やかに繰り返しピペッティングして慎重に再懸濁します。この濃縮されたPRPの血小板数を測定します。必要に応じて、適切な量の自家PPPを追加して、最終的な目標濃度に到達します。
   手記：準備から3時間以内にPRPを使用してください。.
10. PRP1 mLあたり50 μLのCaCl₂(11 mEq 10 mL)を添加して、血小板を活性化します。
11. 調製後約1時間後に、50μLの新鮮なPRPまたは生理食塩水を21Gの針で直接縫合した手術部位に注入します。この間、PRPは室温に保ちます。
12. 手術後とアキレス腱の除去前の数日間、ラットの機能回復を注意深く監視します。

結果

図1:研究の実験デザイン。

図2:外科的処置。

(a) 周囲の筋膜を除去した後の腱複合体。

(b) 足底筋腱の除去。

(c) アキレス腱の一部を切除します。

(d...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キシラジン(キシルM)	VMDの	何一つ	麻酔剤
ケタミン(ジェタミン1000 CEVA)	CEVA サンテ アニマル	何一つ	麻酔剤
ブプレノルフィン(獣医性マルチドーシス)	アルストー	何一つ	痛み止め
イソベタジン	メダ・ファーマ	何一つ	消毒剤
再吸収性糸Vicryl 6/0	ジョンソン・エンド・ジョンソン
ネンブタール	CEVA サンテ アニマル	何一つ	麻酔剤
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148	組織の構造を保持します
イソプロパノール 100%	VWRの	2,09,22,364
エタノール95%	VWRの	2,08,23,362
キシレン	VWRの	28973.363
パラフィン	VWRの	1006年LEIC3950月
ヘマトキシリン	ミリポア	1.15938.0025	着色 剤
エオシン	ミリポア	1.15935.0100	着色 剤
ユーキット	シグマ・アルドリッチ	3989	封入媒体
CaCl2

型 年