方法論記事

ワクチン接種を目的としたmRNAインロードナノ粒子の製剤化

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Fornaguera, C. et al., Synthesis and Characterization of mRNA-loaded Poly(β Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes.J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオでは、高分子ナノ粒子を使用してmRNAワクチン候補を生成する方法を示します。カチオン性ポリマーは、負に帯電したmRNAと相互作用し、ポリプレックスを形成します。ポリプレックスの形成によりmRNAが安定化し、免疫療法アプリケーションにおける将来のmRNAワクチンの候補となる可能性があります。

プロトコル

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1. 末端オリゴペプチドを用いたポリ(βアミノエステル)(pBAE)ポリマーの合成(OM-pBAE)

  1. C6-pBAEの重合
    1. 5-アミノ-1-ペンタノール(38 mmol;MW = 103.16 Da) 1-ヘキシルアミン (38 mmol;MW = 101.19 Da)を丸底ガラスフラスコ(100 mL)に入れます。次に、1,4-ブタンジオールジアクリレート(82 mmol;MW = 198.22 Da)。
    2. シリコーンオイル浴を90°Cに予熱し、丸底フラスコをオイル浴に入れ、磁気攪拌子を使用して混合物を一晩(~18時間)攪拌します。次に、丸底フラスコから製品を取り出し、-20°Cの冷凍庫に入れます
      手記：製品は粘着性のある粉末の形をしており、へらの助けを借りてフラスコから取り出されます。得られたポリマーの構造を1H-NMRでバリデーションすることが不可欠です。NMRスペクトルは、クロロホルム-dとD2Oを溶媒として使用して、400MHzの装置(材料の表を参照)で記録しました。各ポリ(β-アミノエステル)約10 mgを採取し、重水素化溶媒1 mLに溶解しました。
  2. ペプチドと反応してOM-pBAEを得る
    1. 選択したペプチド(例:トリフルオロ酢酸を含むペプチドCys-His-His-His-His)に0.1 M HClを25 mL加え、凍結乾燥に耐え、手動で一晩攪拌して透明な溶液を得ることができる、事前に秤量した50 mL遠心チューブに添加します。
    2. 溶液を-80°Cで1時間凍結し、得られたペプチド塩酸塩を凍結乾燥します.
      注意: 最終的な重量が理論値に対応しているかどうかを確認します。
    3. C6-pBAE(0.031 mmol)をジメチルスルホキシドに溶かします。また、ペプチド塩酸塩(0.078ミリモル)をジメチルスルホキシドに溶かします。
    4. スクリューキャップチューブで2つの溶液を混合し、キャップをねじ込みます。混合物溶液を、温度25°Cに制御された水浴中で、マグネチックスターバーを使用して20時間攪拌します。
    5. 混合物を7:3(v / v)ジエチルエーテル/アセトンに加えます。得られた懸濁液を25,000 x g、4°Cで遠心分離し、溶媒を除去します。次に、固体を7:3(v / v)ジエチルエーテル/アセトンで2回洗浄します。その後、真空下(<0.2気圧)で乾燥させます。
    6. ジメチルスルホキシド中の製品100 mg / mLの溶液を作ります。.得られた生成物はC6-ペプチド-pBAEと命名されます。得られたポリマーの構造を1H-NMRでバリデーションし、末端アクリレートに関連するオレフィンシグナルの消失を確認することが不可欠です。使用しない場合は、ポリマーを-20°Cで凍結できます。

2. ポリプレックスの形成

>注:すべての手順は、一定の温度を維持するために調整された部屋内で実行する必要があります。

  1. ポリマーC6-ペプチド-pBAEを解凍し、溶液をボルテックスします。
  2. ポリマーを上下にピペットで混合し、酢酸ナトリウム(NaAc)に12.5 mM(V1)の溶液を調製します。次に、混合物をボルテックスして10分間待ちます。
  3. メッセンジャーリボ核酸(mRNA)を0.5 mg/mLで調製し、ピペッティング(V2).
    で混合します。 手記：mRNAのボルテックスを避けることが重要です。
  4. 最終濃度でポリマー混合物をボルテックスして、ジメチルスルホキシド(DMSO)のポリマーストックとアセテートバッファーとの間に均一な溶液を作ります。
    手記：最終的なポリマー濃度は、選択したN / P(窒素対リン酸基)の比率によって異なります。N/P比は、使用する各特定のmRNAによって異なります。例えば、強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)カプセル化には、以前に報告されているように、25:1の比率が使用されました。
  5. 遺伝物質溶液とC6-ペプチドpBAE溶液(mRNA濃度の25倍)を1:1(Vi = V1 + V2)の比率で混合します
    手記：C6-ペプチド-pBAEを微量遠心チューブにロードし、ピペッティングで上下に動かしてmRNAを添加して混合します。調製後、ポリプレックス、核酸、およびC6-ペプチド-pBAE濃度を半分に希釈します。
  6. 25°Cで30分間、サーマルブロック内でインキュベートします。1:2 RNaseフリー水で沈殿させるには、あらかじめロードした微量遠心チューブにサンプルを水で加えます。
  7. 賦形剤を含めます。4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)20 mMおよびスクロース4%にmRNAとpBAE(V i)の混合物と同容量をピペッティングで上下させて加えます。この時点で、サンプルは3倍に希釈されています。

3. ポリプレックス凍結乾燥

  1. 瞬時に、前のポリプレックス溶液の-80°C冷凍庫で1時間凍結します。
    2. 次の
  2. 手順に従って一次乾燥を行います:(1)-60°Cおよび0.001hPaで1時間。(2)-40°Cおよび0.0001hPaで1時間。(3)-20°Cおよび0.0001hPaで4時間。(4)5°Cおよび0.0001hPaで12時間。
  3. 使用まで水分補給を避けるために、すぐに-20°Cで保管してください。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,4-ブタンジオールジアクリレートシグマ・アルドリッチ123048
1-ヘキシルアミンシグマ・アルドリッチ219703
5-アミノ-1-ペンタノールシグマ・アルドリッチ411744
アセトンパンレアック141007
クロルヒドロキシドパンレアック181023
クロロホルム-dシグマ・アルドリッチ151823
Cys-His-His-Hisペプチドオントレス習慣
Cys-Lys-Lys-Lysペプチドオントレス習慣
D2O(ディーツーオー)シグマ・アルドリッチ151882
Rnaseフリーウォーター用のDEPC試薬シグマ・アルドリッチD5758この試薬は、MilliQ水を処理してバッファーのRNaseを除去するために重要です
ジエチルエーテルパンレアック212770
ジメチルスルホキシドシグマ・アルドリッチ276855
ヘープスシグマ・アルドリッチH3375-J
mRNA EGFPTriLinkテクノロジーL-7601
RiboGreenキットサーモフィッシャーR11490
酢酸ナトリウムシグマ・アルドリッチ71196
蔗糖シグマ・アルドリッチS0389
トリフルオロ酢酸シグマ・アルドリッチ302031
の

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