アフィニティークロマトグラフィーを用いた自己組織化タンパク質ナノ粒子の精製

Abstract

出典:Karch, C. P. et al., Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation.J. Vis. Exp. (2019年度)

このビデオでは、アフィニティー液体クロマトグラフィーを使用して、ヒスチジンタグ付き自己組織化タンパク質ナノ粒子またはSAPNを精製する様子を紹介しています。得られた精製されたSAPNフラクションは、ワクチン開発に適しており、潜在的な免疫療法への応用が期待されています。

Protocol

1. 大腸菌BL21(DE3)における6ヘリックス束(SHB-SAPN)タンパク質を含む自己組織化タンパク質ナノ粒子コアの発現

1. 製造元の指示に従って、培地の95 mLの成分Aと5 mLの成分Bを2 Lの滅菌ガラス三角フラスコに混合します(材料の表を参照)。.アンピシリンを最終濃度100 μg/mLまで添加します。
2. 培地に、以前に確立されたグリセロールストック培養物から大腸菌を接種します。30°Cで培養物をインキュベートし、毎分200回転(rpm)で48時間
   注:使用済みの大腸菌BL21(DE3)ストックには、SHB-SAPN遺伝子を持つアンピシリン耐性発現ベクターが含まれていました。培地の一般的なプロトコルでは、37°Cで24時間のインキュベーションが推奨されていますが、30°Cで48時間のインキュベーションでは、SHB-SAPNの収量が高くなります。
3. 培養物を2本の50 mLコニカルチューブに移します。チューブを4,000 x gで10分間遠心分離し、固定角ローターを4°Cで遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを保存して細胞を採取します。
   注:細胞ペレットは、すぐに処理することも、使用するまで-80°Cで凍結することもできます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-プロパノール	漁夫	BP26181	4リットル
アンピシリン	漁夫	BP1760-25	25グラム
Corning使い捨て真空フィルター/ストレージシステム	漁夫	09-761-108	さまざまなサイズ
GE Healthcare 5 mL HisTrap HP プレパックカラム	GEヘルスケア	〒45-000-325	5パック
グリセロール	漁夫	BP229-4	4リットル
イミダゾール	漁夫	オ3196-500	500グラム
マジックメディア 大腸菌 エクスプレッション メディウム	サーモフィッシャー	K6803	1リットル
MilliporeSigma Millex 滅菌シリンジ 0.22 mm フィルター	ミリポア	SLGV033RB	250パック
ワンショット BL21 スター (DE3) ケミカルコンピテント 大腸菌	サーモフィッシャー	C601003	20バイアル
リン酸ナトリウム一塩基性	漁夫	BP329-500	500グラム
トリスベース	漁夫	BP152-1	1キロ
尿素	漁夫	BP169-500	2.5キロ
備品
ファイバーライト F14-14×50cy 固定角ローター	サーモフィッシャー	096-145075	ローター
NGC Quest 10 クロマトグラフィーシステム	バイオラッド	7880001	タンパク質精製を支援するFPLC
ソニファー450	ブランソン	別名096-145075	ソニケーター