1. 大腸菌BL21(DE3)における6ヘリックス束(SHB-SAPN)タンパク質を含む自己組織化タンパク質ナノ粒子コアの発現
- 製造元の指示に従って、培地の95 mLの成分Aと5 mLの成分Bを2 Lの滅菌ガラス三角フラスコに混合します(材料の表を参照)。.アンピシリンを最終濃度100 μg/mLまで添加します。
- 培地に、以前に確立されたグリセロールストック培養物から大腸菌を接種します。30°Cで培養物をインキュベートし、毎分200回転(rpm)で48時間
注:使用済みの大腸菌BL21(DE3)ストックには、SHB-SAPN遺伝子を持つアンピシリン耐性発現ベクターが含まれていました。培地の一般的なプロトコルでは、37°Cで24時間のインキュベーションが推奨されていますが、30°Cで48時間のインキュベーションでは、SHB-SAPNの収量が高くなります。
- 培養物を2本の50 mLコニカルチューブに移します。チューブを4,000 x gで10分間遠心分離し、固定角ローターを4°Cで遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを保存して細胞を採取します。
注:細胞ペレットは、すぐに処理することも、使用するまで-80°Cで凍結することもできます。
2. 超音波処理による大腸菌BL21(DE3)の溶解
>注:非発熱性のプラスチック製品とガラス製品を250°Cで少なくとも30分間焼いたものを使用してください。還元剤として、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)は、タンパク質内およびタンパク質間のジスルフィド結合を切断します。TCEPは、表示された抗原にS-S結合が含まれている場合、このプロトコル中のバッファーに必要です。SHB-SAPN コアの場合のみ、バッファーに TCEP が存在することは必須ではありません。
- イミダゾールフリーの緩衝液(8 M尿素、50 mMリン酸ナトリウム一塩基性、20 mMトリス塩基、5 mM TCEP)pH 8.0(5 N水酸化ナトリウム、NaOHで調整)を調製し、0.22 μm真空ボトルろ過ユニットを使用してろ過します。
- ペレット化した細胞(ステップ1.3から)を、50 mLのコニカルチューブ1本に40 mLのイミダゾールフリー緩衝液で再懸濁します。再懸濁した細胞を氷上のプローブで5分間(4秒の超音波処理、6秒の静止)超音波処理出力150Wで超音波処理します。
- 細胞ライセート(40 mL)を29,000 x g、4°C、固定角ローターで25分間遠心分離し、清澄化した上清を生成します。上清を150mLの滅菌フラスコに移し、ペレットを廃棄します。イミダゾールフリーバッファー(プロトコルの後半では「サンプル」と呼びます)を使用して、上清を100mLに希釈します。
注:この希釈ステップは、カラムへのライセートローディング中に高速液体クロマトグラフィー(FPLC)システム圧力が高くなりすぎるのを防ぐために必要です。
3. Hisカラムによるタンパク質精製
>注:このプロトコルはFPLC機器を使用して実行されましたが、重力の流れに適応させることができます。
- 次のバッファーを調製し、0.22 μm真空ボトルろ過ユニットを使用してろ過します:(i)イミダゾールフリーバッファー「バッファーA」(8 M尿素、50 mMリン酸ナトリウム一塩基、20 mMトリスベース、5 mM TCEP)pH 8.0;(ii)500mMイミダゾール緩衝液「バッファーB」(8M尿素、50mMリン酸ナトリウム一塩基性、20mMトリス塩基、5mM TCEP、500mMイミダゾール)pH 8.0;(iii)イソプロパノール洗浄(20 mM Tris、60%イソプロパノール)pH 8.0.
注:各バッファーのpHは5N NaOHで調整しました。
- Hisカラムを平衡化します.
注:ラボスケールでの生産では、このプロトコールでは5 mLのプレパックHisカラムを使用しますが、より大きなサイズのカラムを使用することができます。
- FPLCソフトウェアを開き、[新しいメソッド]オプションをクリックします。すぐにメソッド設定メニューが開きます。列の位置のドロップダウンメニューで、C1ポート3を選択します。
- [表示方法] ドロップダウン メニューで、[アフィニティ] を選択します。[カラムタイプ]ドロップダウンメニューで、その他の[Histrap HP]、[5 mL]を選択します。カラム容量と圧力ボックスは、自動的に適切な値に設定されます。
- [メソッドの概要]ボタンをクリックします。[Phase library]ポップアップメニューから、矢印の横にある[equilibration]、[sample application]、[column wash]、および[elution]ボタンを正確な順序でドラッグします。[フェーズ ライブラリ] メニューを閉じます。
- 平衡化ボタンをクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファ B」(4%)、「最終バッファ B」(4%)、「ボリューム(CV)」の 5 である必要があります。
- [サンプル アプリケーション] ボックスをクリックします。サンプルローディングボックスで、サンプルポンプを使用してカラムにサンプルを注入するラジオボタンをクリックします。[システムポンプによるサンプル注入]ボックスで、[メソッド設定から流量を使用]の横にあるボックスにチェックが入っていることを確認します。画面右側の容量ボックスの横にある値を20mLに変更します。
- カラム洗浄ボタンをクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファ B」(4%)、「最終バッファ B」(4%)、「ボリューム(CV)」の 5 である必要があります。分数集成スキームの横にある [有効] ボックスのクリックを解除します。
- 溶出ボタンをクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファB」0%、「最終バッファB」100%、「ボリューム(CV)」5である必要があります。分数集成スキームの横にある[有効]ボックスをクリックします。メソッド設定の「Use fraction size」のクリックを外し、下のフィルインボックスでフラクションサイズを 4 mL に調整します。
- ソフトウェアの上部にある[名前を付けて保存]ボタンをクリックします。ファイルに "equilibration" という名前を付けます。
- 5 mLのプレパックHisカラムをFPLCの対応するカラムポート3に接続します。ポンプAとポンプBの両方のチューブ、およびサンプルポンプチューブは、0.22 μmのろ過済み脱イオン水に入れる必要があります。平衡化プログラムを実行します。
- ポンプAとポンプBの両方、およびサンプルポンプチューブをイミダゾールフリーのバッファー(バッファーA)に入れ、平衡化プロトコルを再度実行します。
- サンプルをカラムに結合し、タンパク質を精製します。
- FPLCソフトウェアを開き、[新しいメソッド]オプションをクリックします。すぐにメソッド設定メニューが開きます。[Column] のドロップダウン メニューで、[C1] ポート 3 の位置を選択します。[表示方法] ドロップダウン メニューで、[アフィニティ] を選択します。カラムタイプのドロップダウンメニューで、その他、Histrap HP、5 mLを選択します。カラム容量と圧力ボックスは、自動的に適切な値に設定されます。
- [メソッドの概要]ボタンをクリックします。Phase library(フェーズライブラリー)ポップアップメニューから、矢印の横にあるボタン(equilibration、sample application、column wash (Wash 1)、column wash (Wash 2)、column wash (Wash 3)、Elution の順にドラッグします。[フェーズ ライブラリ] メニューを閉じます。
- Equilibrationボタンをクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファ B」 4%、「最終バッファ B」 4%、「ボリューム (CV)」5 である必要があります。
- [サンプル アプリケーション] ボックスをクリックします。サンプルローディングボックスで、サンプルポンプのあるカラムにあるI njectサンプルのラジオボタンをクリックします。システムポンプを使用したサンプル注入の[メソッド設定から流量を使用]の横のボックスがオンになっていることを確認します。
- 画面右側の容量ボックスの横にある値を 100 mL に変更します。分数集成方式の横にある「有効」ボタンをクリックします。メソッド設定の「Use fraction size」ボックスのチェックを外し、フラクションサイズを 4 mL に変更します。
- 最初のカラム洗浄ボタン(Wash 1)をクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファ B」 4%、「最終バッファ B」 4%、「ボリューム (CV)」10 である必要があります。分数集成方式の横にある [有効] ボックスをクリックします。「メソッド設定のフラクションサイズを使用」のクリックを解除し、フラクションサイズを 4 mL に変更します。
- 2 番目のカラム洗浄ボタン (Wash 2) をクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファB」0%、「最終バッファB」0%、「ボリューム(CV)」5である必要があります。分数集成方式の横にある [有効] ボックスをクリックします。「メソッド設定のフラクションサイズを使用」のクリックを解除し、フラクションサイズを 4 mL に変更します。
- 3列目の洗浄ボタン(Wash 3)をクリックします。表に記載されている値は、「初期バッファB」0%、「最終バッファB」0%、「ボリューム(CV)」5である必要があります。分数集成スキームの横にある [有効化] をクリックします。メソッド設定の「Use fraction size」ボックスのチェックを外し、フラクションサイズを 4 mL に変更します。
- Elutionボタンをクリックします。右側のテーブルで、一覧表示されている情報をクリックし、表示されるメニューで [削除] ステップをクリックします。アイソクラティックグラデーションボタンをテーブルに2回ドラッグして、2つのエントリがあるようにします。
- 最初のエントリの値は、"初期バッファー B" 30%、"最終バッファー B" 30%、"ボリューム (CV)" 10 と読み取る必要があります。2 番目のエントリの値は、"初期バッファー B" 100%、"最終バッファー B" 100%、"ボリューム (CV)" 10 と読み取る必要があります。分数集成方式の横にある「有効」ボタンをクリックします。[方法設定の分数サイズを使用] の横にあるボックスをクリックします。
- ソフトウェアの上部にある[保存]ボタンをクリックします。ファイル名を「purification」とし、FPLC のポンプ A チューブはイミダゾールフリーの洗浄バッファーに、ポンプ B チューブは 500 mM のイミダゾールバッファーにセットします。サンプルポンプチューブは、100 mLサンプルに入れる必要があります。
- 「精製」プログラムを実行し、60%イソプロパノールが必要となるのを待ちます(洗浄2)。プログラムを一時停止します。ポンプAチューブをイミダゾールフリー洗浄液から60%イソプロパノール洗浄液に移します。プログラムを再起動します。
- イソプロパノールステップが完了したら、プログラムを再度一時停止し、ポンプAチューブをイミダゾールフリーの洗浄バッファーに戻します。.精製プログラムを再起動します(残りの実行は自動化されます)。
