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サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. CD4キメラ抗原受容体を用いたヒト化マウスの作製
- 胎児胸腺のプロセッシングと胎児肝臓からのCD34+ HSCの単離
- 胸腺の処理
- 15 mLの円錐形チューブで、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で胸腺をやさしく洗います。洗浄手順を3〜4回繰り返します。
- 7 mlのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地+ 10%ウシ胎児血清(FBS)+ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)を追加します。.滅菌済みの100mmペトリ皿にすべてをデカントします。
- メスを使用して、胸腺を約1mm2の小片に切ります。すべての胸腺片を96ウェルプレート上の1つのウェルに入れます。胸腺片を96ウェルプレートに移すときは、湾曲した鈍い鉗子を使用してください。
- 少量の培地(100〜200μl)をすべてのウェルに加え、組織が乾燥しないようにします。顕微鏡で視覚化します(胸腺には葉があり、細胞の袋のように見えるはずです).
手記：何らかの形で疑わしいと思われるピースは捨ててください。結合組織が存在することが多く、これは移植すべきではありません。
- 確認された胸腺片を取り出し、それらすべてをT25細胞培養フラスコに入れます。10% FBSと450 μg/mlのピペラシリン/タゾバクタムおよびアムホテリシンBを添加した7 mLのRPMI培地を加えます。フラスコを37°C/5%CO2.
で一晩培養します
手記： このステップは、組織の細菌汚染を防ぐために必要です。
- (オプションの手順)将来の使用のために胸腺を凍結します。90% ヒト AB 血清中のチャンクを 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 分間平衡化します。1°C/分から-50°Cまで凍結し、次に-150°Cまで急冷します。解凍する準備ができたら、37°Cのウォーターバスで急速に解凍し、DMSOを含まないRPMI完全メディアで3x優しく洗浄します。
- 肝臓の処理
- 50mlの円錐形チューブで肝臓をPBSでやさしく洗います。洗浄手順を3〜4回繰り返します。
- 10 mlのIscove's Modified Dulbecco's Media(IMDM)を50 mlのコニカルチューブに加えます。すべてを100mmの滅菌ペトリ皿にデカントします。
- 2つのメスを使用して肝臓組織を均質化します。肝臓を約3mm2の小片に切ります。白い結合組織を切り取って捨てます。
- 16ゲージの鈍い針を取り付けた10mlのシリンジを使用して、肝臓片と培地を取り込みます。その後、50mlのコニカルチューブに移します。
- 培地と組織の懸濁液を再懸濁し、さらに5〜7回排出して組織を完全に均質化します。
- 酵素を添加した10 mLのIMDM培地を調製します:500 U/mlコラゲナーゼ、2,400 U/mlヒアルロニダーゼ、300 U/mL DNase、450 μg/mlのピペラシリン/タゾバクタム、アムホテリシンB.0.22 μmフィルターで培地をろ過し、培地を肝臓懸濁液に加えます。
- 肝臓懸濁液が入った50mlのコニカルチューブにキャップをし、漏れを防ぐためにパラフィルムなどのセルフシールフィルムでしっかりと密封します。インキュベーター内のチューブローテーター内で37°Cで90分間回転させます。
- 消化した細胞懸濁液を100 μmの細胞ストレーナーで濾過し、新しい50 mLのチューブに入れます><。
手記：懸濁液にPBSを加えて、総容量を50mlに増やします。これを2本の50mlチューブに分割し、それぞれに25mlの細胞懸濁液を入れます。
- 各チューブ内の細胞を10 mLの密度遠心分離培地(Ficollなど)でゆっくりと穏やかにアンダーレイします。1,200 x gでブレーキなしで20分間回転します。注:このプロトコルに記載されているすべての遠心分離は、室温(25°C)で行われます。
- 各チューブからインターフェース(つまり、バフィーコート)を慎重に取り外し、2つの別々の50 mlチューブに移します。インターフェースの各チューブの容量をPBSで最大50mlにします。300 x gで7〜10分間遠心します。上清を慎重に吸引します。
- 2つのペレットを組み合わせます。2%FBSを含む50mlのPBSでさらに3回洗浄します。300 x gで7〜10分間、上清を慎重に吸引しながら回転させます。
- ペレットを50 mL RPMI培地+ 10% FBSに再懸濁します。細胞の選別に進む前に、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 製造元のプロトコルに従って、CD34 Sorting Kit(例:CD34マイクロビーズ)を使用してCD34+細胞を直ちに選別します
手記：あるいは、細胞をRPMI培地+ 10%FBSで100万/mLで一晩培養することもできます。
- CD34+とCD34-の両方の分数を保存します.
手記：このステップでは、CD34+およびCD34-細胞をBambanker凍結培地または他の凍結培地を使用して凍結することができます。チューブあたり4 - 6 x 106 CD34 +細胞1 mLを凍結し、チューブ1本あたり40 - 60 x 106 CD34-細胞1 mLを凍結します。
- CD34+細胞の形質導入
- 6ウェル組織培養プレートに必要な形質導入ウェルの数を計算します。1つのウェルを使用して、最大8 x 106細胞を形質導入できます。各骨髄/肝臓/胸腺 (BLT) マウスについて、0.5 x 106 CD34+ 細胞が CD34- 細胞と胸腺と共に腎臓カプセルの下に移植され、0.5 x 106 CD34+ 細胞が静脈内注射されます。使用するCD34+細胞の数は、マウスの数(マウスあたり100万個の細胞)によって決まります。
- 必要な数の非組織培養処理済み6ウェルプレートウェルに、1.25 mlの組換えヒトフィブロネクチン溶液(レトロネクチンなど)(PBSで20 μg/ml)を各ウェルにコーティングします。プレートを覆い、清潔なバイオセーフティキャビネットで室温で2時間放置します。
- ウェルからフィブロネクチン溶液を吸引し、1.25 mLの蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(PBSと4% FBS)を各ウェルに加えてブロッキングします。プレートを室温(25ºC)で30分間放置します。
- FACSバッファーを吸引し、PBSでウェルを一度洗浄します。
- プレートが使用可能になるまで、PBSをコーティングされたウェルに保管してください。プレートをすぐに使用しない場合は、プレートを4°Cで一晩保管してください。
- CD34+細胞を感染培地(Yssel's Serum-Free T細胞培地中の2%ヒト血清アルブミン)にPplating in Fibronectin solution-coated wells(~2 x 106細胞/mL)に入れ、37°Cで1時間インキュベー
トします。
- ピペットを使用して、レンチウイルスベクターを2〜10の感染の多重度(MOI)でウェルに添加します。穏やかに混合し、37°Cで一晩インキュベートします
手記： 使用するレンチウイルスベクターの力価は、事前に決定する必要があります。
- 翌日、細胞スクレーパーでウェルの底をそっとこすり落とし、細胞を収穫します。細胞を採取し、血球計算盤でカウントします。
- インプラント用の細胞を調製するには、0.5 x 106形質導入CD34+細胞をマウスあたり4.5 x 106 CD34-細胞と組み合わせ、滅菌済みの1.5 mlスクリューキャップチューブに分注します。細胞を300 x gでペレットにスピンダウンし、上清を吸引します。それらを300 x gで再度回転させ、P10ピペットを使用して残りの上清を吸引し、非常に慎重に吸引します。研究中、乾燥したペレットを氷の上に置いておきます。手記：細胞が生存可能であることを確認するために、ペレット化された細胞を使用し、2〜3時間以内に手術を行います。
- 注射用の細胞を調製するには、マウスあたり0.5 x 106形質導入CD34+細胞をスピンしてペレット化し、上清を吸引します。マウスあたり100 μl RPMI培地に細胞を再懸濁し、氷上に保管します。
- 形質導入効率を確認するために、各条件の ~1 x 105 の非形質導入および形質導入した CD34+ 細胞を 200 μl サイトカイン 培地 (10% FBS を含む RPMI 培地、100 ng/ml ヒト IL-3、IL-6、SCF を添加) で 96 ウェルプレートで 37 ºC.
手記： このステップで使用される細胞は手術には使用されませんが、形質導入が成功し、ベクターが幹細胞の生存と再生に毒性がないことを確認するために使用されます。形質導入効率は、ベクター(GFP&CD4など)の遺伝子発現を探すことで確認でき、フローサイトメトリーで分析できます。
- 遺伝子改変マウスを作製するための組織移植
- 手術前と同じ日に、NODの全身照射を行います。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 免疫不全マウス、セシウム-137照射器、2.7 Gy(270Rad).
手記：NSGマウスは重度の免疫不全です。したがって、彼らの住居とメンテナンスは最高の健康基準に準拠し、高度な訓練を受けたスタッフによって処理されなければなりません。
- フラスコから胸腺片と培地を60mmの皿に注ぎます。PBSを別の60mmの皿に注ぎ、トロチャーをきれいにし、腎臓を濡らしておくために使用されます。
- 容積式ピペットチップを氷上の開いた1.5 ml滅菌スクリューキャップチューブに入れて冷やします。乾燥させた細胞ペレットとMatrigel.
などのゼラチン状タンパク質混合物で氷上に保ちます。
手記：ゼラチン状のタンパク質混合物と、インプラント針がロードされるまで、それに触れるチューブやチップを冷たく保つことが重要です。
- マウスに麻酔をかける:マウスの体重を個別に測定し、体重を記録します。マウスに耳を叩いて番号を付けます。体重1グラムあたり15μlのケタミン(生理食塩水で2.6 mg / ml)/キシラジン(生理食塩水で100 mg / ml)を腹腔内に注射します。マウスをケージに戻し、完全に麻酔がかかるのを待ちます。
手記： 足を絞ってマウスの麻酔レベルを確認します。マウスが反射的にひるむ場合は、元の量の25〜50%のケタミン/キシラジンを投与して、マウスをさらに麻酔します。.反射的にひるまなくなるまで待ってから手術を行います。
- オスタークリッパー(シェーバー)を使用して、各マウスの左側を腰から肩まで背中の中心と胃の間で剃ります。0.3 mlの希釈したCarprofen(6 mg / kg)を動物の肩または鼠径部の三角形(脚の穴)に皮下注射します。.綿棒を使用して、人工涙液の小さな滴を各目に置き、マウスをケージに横向きに置きます。
手記： 手術の準備は一度に1つのケージ(約4〜5匹のマウス)に制限します。
- 16ゲージのがんインプラント針(トロカール)のカニューレをPBSで洗い流します。一対の鈍く湾曲した鉗子を使用して、60mm皿から胸腺の一部をカニューレの開口部に配置し、トロカールを開口部のすぐ内側に置き、次にトロカールを引き戻して組織をカニューレに吸引します。
- 容積式ピペットと冷却チップを使用して、乾燥した細胞ペレット (移植された細胞の場合はCD34+およびCD34-混合物) を入れたチューブに5 μlの冷たいゼラチン状タンパク質混合物を入れ、穏やかに攪拌して細胞懸濁液を生成します。ピペットで上下させないでください。ゼラチン状タンパク質混合物/細胞懸濁液をカニューレの開口部にピペットで入れ、トロカールをゆっくりと引き戻して針をロードします.
手記：インプラント針を操作しながらピペットをロードするためのヘルパーを用意することをお勧めします。
- マウスの剃った部分をポビドンヨードで拭き取り、続いてアルコールワイプでその部分を3回拭きます。皮膚の下の最も暗い部分を特定します。これは脾臓の位置を示します。腎臓は脾臓に対して約5mm背側にあります。湾曲した鉗子で皮膚を持ち上げ、脾臓に平行な皮膚に手術用ハサミで長さ15mmの切開を行います。次に、下の腹膜層にも同様の切り込みを入れます。男性では、腎臓は簡単に見えるはずで、腹部を押すだけで押し出すことができます。止血剤または湾曲した鈍い鉗子で腎臓を支えることができます。女性では、卵巣が腎臓を簡単に抽出するのを妨げる傾向があります。止血剤を使用して、卵巣を摘み取り、腎臓を慎重に露出させます。
- 針の先端を持つ鉗子を使用して、腎臓嚢の後端にある小さな穴を摘み取ります.
手記：これらの針先鉗子をバイオハザード物質の取り扱いに使用しないでください。
- インプラント針をこの穴にスライドさせ、カニューレの開口部が腎臓カプセルで完全に覆われるまで腎臓に沿ってスライドさせます。
- 腎臓嚢の下の組織をそっと押し出し、針を引き出します。胸腺片はべたつく可能性があるため、湾曲した鉗子を使用して、胸腺片が針と一緒に出ないようにします。
- 鉗子で腹膜を持ち上げ、止血剤をそっと使用して腎臓を元の位置に戻します。腹膜にダブルノットステッチを1つ結び、4-0ビクリル吸収性縫合糸を使用します。2つのAutoclips巻きクリップを使用して、皮膚を閉じます。
- 注射用に取っておいた形質導入CD34+細胞を混合し、100 μl(0.5x106細胞)をインスリン注射器に取り込みます。これらの細胞を眼窩後静脈注射または静脈内注射の他の経路を通じてマウスに注入します。綿棒を使用して、人工涙液を各目に少量ずつ入れ、マウスをケージに背向けに寝かせます。
- すべてのマウスが移植されたら、動物が意識を取り戻し、正常に歩き回っていることを確認してから、マウスを離れます。
- 術後ケア:手術の翌日に、希釈したCarprofen(6 mg / kg)0.3 mlと滅菌生理食塩水1.2 mlを各マウスに皮下注射します。手術の2日後と3日後に、各マウスに1.5 mlの滅菌生理食塩水を皮下注射します。手術後10〜14日間、マウスと切開部を監視します。オートクリップを取り外し、10〜14日後にマウスの体重を量ります。手記： マウスは放射線照射後に動きが鈍くなり、生理食塩水の注射により動物の脱水症状を防ぎます。
- 8〜10週間後、マウスを出血させ、末梢血のFACS分析を行い、CD45、CD3、CD4、CD8などのマーカー、およびベクターが発現するはずの任意の遺伝子を染色することにより、生着を確認します。