骨髄幹細胞からの原形質膜小胞の生成

要約

出典:Xu, L. et al., Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy.J. Vis. Exp. (2017年度)

この動画では、骨髄幹細胞をメンブレンフィルターに素早く通すことで、骨髄幹細胞から原形質膜ベシクルを生成する方法を実演しています。これらのPMVは、細胞質補充療法の可能性を示しています。

プロトコル

1. 装置の組み立て

1. 無菌性を確保するため、使用前に組織培養フードの紫外線(UV)を30分間オン
にしてください。
2. 使い捨ての25mmフィルターユニットを緩め、ユニットのキャップと底を75%エタノールで満たされた200mLのガラスカップに30分間沈めます。ユニットは医療グレードのポリプロピレン製です。
3. 鉗子を使用してユニットのキャップと底を持ち上げ、残りのエタノールを手で振り落とし、ボンネット内で部品を10分間風乾させます。
4. 19 mmのポリカーボネートメンブレンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で濡らし、ユニット底部の支持マトリックスの上に慎重に置きます。ポリマーフィルムは、滑らかで平らな表面とトラックエッチングされた3μmの細孔を持っています。
5. キャップを底部にしっかりとねじ込んで、ユニットを組み立て直します。メンブレンが中心から外れていないことを確認してください。
6. 1 mLのインスリン注射器の針を取り外し、1 mLのPBSを引き出します。.シリンジをフィルターユニットに取り付けてから、PBSをユニットに押し込んでアセンブリを濡らし、漏れがあるかどうかをテストします。

2. 原形質膜小胞(PMV)の生成

1. Nemeth et al. によって報告されたように、15% のウシ胎児血清 (FBS) と 1% のペニシリン/ストレプトマイシンを含む Dulbecco の Modified Eagle Medium (DMEM) 培養培地で、骨髄間葉系幹細胞 (BMSC) 培養を確立します。5% CO₂ を含む 37 °C の加湿インキュベーター内の 6 ウェルプレートで細胞を培養します。
2. 細胞を増殖させるには、培地を取り出し、0.5 mLのカルシウムフリーPBSでウェルをすすぎます。
3. 0.5 mLの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(トリプシン-EDTA)を加え、細胞を37°Cで3分間インキュベートします。1 mLの培地を加えて消化を停止します。
4. 細胞を15 mLのコニカルチューブに集め、ベンチトップ遠心分離機で200 x gで2分間遠心します。細胞を4 mLの培養培地に再懸濁し、細胞を6ウェルプレートの2つのウェルに分注します。
   手記：細胞は通常、約24時間でコンフルエンスに達します。
5. PMVを生成するには、トリプシン消化により6ウェルプレートの1ウェル(約5 x 10⁵細胞)から細胞を回収し、0.5 mLの培地で細胞を単分散します。
6. 細胞をインスリン注射器にロードし、フィルターユニットに取り付け、プランジャーをすばやく押して細胞をフィルターに押し込みます。押し出された媒体は、内部に数個のPMVしか存在しないはずなので、廃棄します。
7. さらに0.5 mLの培地をシリンジに入れ、すばやくフィルターに押し込みます。さまざまなサイズのPMVを含む2番目の押出成形の媒体を収集しました。
8. 採取した培地150μLを35mmガラス底皿に投入し、PMVを約10分間底に沈殿させます。CCDカメラを搭載した倒立位相差顕微鏡で、20倍対物レンズを用いてPMVを観察する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IsoporeTMメンブレン	ミリポア	TSTP04700	3mmの細孔
使い捨てフィルターユニット	辛亜、上海、中国	25ミリメートル	医療グレードのポリプロピレン
インスリン注射器	BDの	328446	1ミリリットル