抗血管新生性腫瘍関連好中球の作製

要約

出典:Pylaeva, E., et al. Transferred of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Their Angiogenic Potential In Vivo. J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、抗血管新生腫瘍関連好中球(TAN)を生成するアッセイを示しています。血管新生促進性TANを含むマウス黒色腫を採取すると、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して単一細胞を単離し、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)の阻害剤で治療して血管新生を刺激する能力を低下させます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>注: プロトコルの全体的なスキームを図 1 に示します。

1. B16F10メラノーマ細胞株の調製

1. 完全なイスコーブ修飾ダルベッコ培地(IMDMc:IMDM + 10%ウシ胎児血清(FBS)+ 1%ペニシリン-ストレプトマイシン)で90%コンフルエント単層(約10 x 10⁶細胞/ T75フラスコ)に増殖したマイコプラズマ陰性細胞を調製します。
2. 培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞をすすぎます。タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素を含む細胞剥離溶液6 mL(材料表を参照)を適用し、37°Cで2分間インキュベートします。
3. フラスコを軽くたたき、残りの付着細胞を下から動員します。細胞懸濁液を15 mLチューブに集め、300 x gで7分間、20°Cで遠心分離します。
4. 上清を取り除き、ペレットをPBS1 mLによく懸濁します。14 mLのPBSを加え、遠心分離機(300 x gおよび20°Cで7分間)します。
5. 上清を取り除き、ペレットを1mLのPBSに再懸濁します。
6. 細胞をカウントし、3 x 10⁶/mL PBS(ステップ2の場合)または6 x 10⁶/mL PBS(ステップ6の場合)の濃度まで再懸濁して注射します。細胞を最大30分間氷上に保ちます。

2. マウスの同種腫瘍モデル

1. 特定の病原体を含まない(SPF)条件下で飼育されている8〜12週齢の10匹の雌Ifnar1-/-マウスを使用します
   手記： 雌マウスは、腫瘍増殖の皮下モデルで好まれます、なぜなら、雄はより攻撃的であり、したがって腫瘍部位の侵害を受けやすく、腫瘍増殖に影響を与えるからです。
2. 電気シェーバーで側面のマウスの皮膚を剃り、70%エタノールで濡らしたティッシュで皮膚を消毒します。
3. 調製したB16F10メラノーマ細胞を3 x 10⁶ / mL PBS(ステップ1を参照)の濃度で1 mLシリンジと0.4 x 19 mm針で収集します。懸濁液100μLを皮下注射します。
   1. 毎回の注射の前に細胞を十分に混合します。腫瘍細胞を乱さないように、直径0.4mm以上の針を使用してください。
4. 1つのケージに最大5匹のマウスを入れ、ノギスで腫瘍の大きさ(長さ、幅、深さ)を14日間コントロールします
   手記：動物の規制によると、腫瘍のサイズは直径15 mmを超えてはならず、より大きな腫瘍または壊死性/開放性腫瘍を持つマウスは事前に犠牲にする必要があります。
5. 14日目に、CO₂チャンバーでマウスを犠牲にします。
6. 70%エタノールで皮膚を消毒し、滅菌ペトリ皿でハサミと鉗子で腫瘍を切除します。腫瘍を氷上の完全なダルベッコ修正イーグル培地(DMEMc:DMEM + 10%FBS + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン)の50mLチューブに保管します。.

3. TANの分離

1. 腫瘍を滅菌済みの6ウェルプレート(ウェルあたり5つの腫瘍)に入れます。腫瘍を滅菌ハサミで2〜3mmに切ります。
   1. 腫瘍1 mLのディスパーゼ/コラゲナーゼD / DNase I溶液(0.2 mg / 0.2 mg / 100 mg in 1 mL of DMEMc)で消化します。.湿潤インキュベーターで37°C、5%_CO2でインキュベートし、針なしの10 mLシリンジで15分ごとに3回混合します。
2. 未消化の繊維を除去するには、100 μmフィルターで細胞を15 mLチューブにメッシュ化します(チューブ1本につきフィルター1ウェル)。PBSを15 mLに加え、チューブを460 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。
3. 各チューブに1 mLを添加し、溶解バッファー(NH₄Cl 150 mM、KHCO₃ 10 mM、EDTA 0.1 mM、pH 7.3、20 °C)で赤血球を溶解します。よく混ぜ合わせ、すべてのチューブの溶液を1つに混ぜ合わせます。2分後、11 mLの氷冷(4 °C)DMEMcで反応を停止します。
4. 460 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットを15mLの冷たいPBSで再懸濁します。460 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。
5. ペレットをPBS1 mLに再懸濁します。3 μLのFcブロック抗体(CD16/CD32、ストック0.5 mg/mL)を加え、氷上で15分間インキュベートします。
6. 抗体を添加します:10 μLのLy6G-フィコエリトリン(Ly6G-PE、ストック0.2 mg/mL)および10 μLのCD11b-アロフィコシアニン(CD11b-APC、ストック0.2 mg/mL)を添加します。20 μL の 6-ジアミジン-2-フェニルリンドール生存率色素 (DAPI、ストック 5 mg/mL) を加え、氷上で暗所で 30 分間インキュベートします
   手記：生存率色素と抗体の蛍光コンジュゲートの別の組み合わせを使用することができます。
7. PBSを15mLまで添加し、460 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。
8. ペレットをDMEMcで約10 x 10⁶ / mLの濃度に再懸濁し、氷上に保管します。
9. CD11b⁺ Ly6G^hi alive (DAPI陰性) 好中球を蛍光活性化セルソーターで選別します (ゲーティング戦略 図 2 を参照).
   手記：細胞懸濁液入りチューブとDMEMc入りチューブを4°Cに保ち、最適な選別設定を使用します:70μmノズル、最大22,000イベント/秒の閾値レート、1〜3の流量。
10. サイトメーターを使用して、選別した好中球の純度を>95%の推奨純度で確認してください。
11. 好中球を460 x g、4°Cで5分間遠心選別し、上清を除去します。選別した細胞をDMEMcで1 x 10⁶/mL.
    の濃度に再懸濁します。 手記： 1つの14日間のB16F10腫瘍(直径10mm)における好中球の予想数は、約3 x 10⁴細胞です。

4. in vitroでのTANsにおけるNAMPT阻害

1. ジメチルスルホキシド(DMSO)にFK866(NAMPT阻害剤)を最終濃度100 mMで調製します。
2. シードは、好中球を選別(ステップ3.11)を96ウェルU底プレート(1.5 x 10⁵好中球/ウェル)の2ウェルに選別しました。FK866を介入ウェル(最終濃度100 nM)に加え、DMSOを含むDMEMcを同量コントロールウェルに加えます。湿潤インキュベーターで37°C、5%CO₂で2時間インキュベートします。
3. 460 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。各ウェルのPBS200 μLに再懸濁します。2回繰り返します。
4. 460 x g、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。市販の内皮細胞増殖培地(4 μL/mL内皮細胞増殖サプリメント、0.1 ng/mL組換えヒト上皮成長因子、1 ng/mL組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、90 μg/mLヘパリン、1 μg/mLヒドロコルチゾンを添加)で最終濃度0.2 x 106 cells/mL(0.75 mL中)(ステップ5用)またはPBSで最終濃度0.6 x 10⁶細胞/mL(0.25mLで)です。

結果

図 1.プロトコルのスキーム。ステップ1.B16F10メラノーマ細胞株の調製;2.マウスの同種腫瘍モデル。3.腫瘍からのTANの分離。4. in vitroでのTANにおけるNAMPTの阻害;5.大動脈環アッセイにおけるTANの血管新生特性の推定。6.同種腫瘍モデルにおける治療された好中球の養子移植。7.腫瘍増殖モニタリング、組織学的検査。

図 2.TAN ソートのゲーティング戦略。CD11b⁺ Ly6G^hi alive好中球は、純度≥95%の腫瘍から選別...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15mlチューブ	Sarstedt AG & Co., ニュンブレヒト, ドイツ	6,25,54,502
50mlチューブ	Cellstar、Greiner Bio One International GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ	227261
自動ピペット用の5ml / 10ml / 25ml滅菌チップ	Cellstar、Greiner Bio One International GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ	6006180 / 607180 / 760180
6ウェル平底細胞培養プレート	Sarstedt AG & Co., ニュンブレヒト, ドイツ	8,33,920
96ウェル平底細胞培養プレート	Cellstar、Greiner Bio One International GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ	655180
96ウェルU底細胞培養プレート	Cellstar、Greiner Bio One International GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ	65018
抗マウスCD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, アメリカ合衆国	553312	クローン M1/70、APC 標識、0.2mg/mL
抗マウスLy6G	BioLegend、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	127608	クローン 1A8、PE 標識、0.2mg/mL
BD FACS アリアII	BD Biosciences、Becton Dickinson、フランクリン レイクス、米国		セルソーター
キャリパー	フォーゲルドイツ、ケヴェラー、ドイツ
Casyセルカウンター	Innovatis, Roche Innovatis AG, ビーレフェルト, ドイツ
Cell Trics 50μm / 100 μm 滅菌フィルター	Sysmex Partec GmbH、ゲルリッツ、ドイツ	04-004-2327 / 04-004-2328
遠心分離機 Rotina 420 R	Andreas Hettich、トゥットリンゲン、ドイツ	4706
コラゲナーゼD	Sigma-Aldrich/Merck、ダルムシュタット、ドイツ	11088858001
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、乳酸)	BioLegend、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	422801	在庫: 5mg/ml
ディスパーゼI	Sigma-Aldrich/Merck、ダルムシュタット、ドイツ	D4818-2MG
DMEM	Gibco、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国	41966から029	DMEMコンプリート:DMEM + 10%FBS + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン
DMSO(ジメチルスフキシド)	WAK-Chemie Medical GmbH、シュタインバッハ、ドイツ	ワック-DMSO-10	CryoSure-DMSO (クライオシュア-DMSO)
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck、ダルムシュタット、ドイツ	DN25-100MG
DPBSの	Gibco、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国	14190から094
内皮細胞増殖培地	PromoCell、ハイデルベルク、ドイツ	C-22010
FBS(ウシ胎児血清)	Biochrom、ベルリン、ドイツ	S0115
Fcブロック(アンチマウスCD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, アメリカ合衆国	553142	クローン 2.4G2、ストック:0.5mg/mL
FK 866塩酸塩	Axon Medchem、フローニンゲン、オランダ	アクソン1546	在庫: 100 mM
ヤギ抗ウサギIgG H&L	アブカム、ケンブリッジ、英国	ab97075	Cy3-標識、ストック:0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	51026334
IMDM	Gibco、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国	12440-053	IMDMコンプリート:IMDM + 10%FBS + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン
Isis GT420シェーバー	B. Braun Asculap、ズール、ドイツ	90200714
マトリゲル基底膜	Corning Life Sciences(オランダ、アムステルダム	7205011
モノクローナル抗アクチン、α平滑筋	Sigma-Aldrich/Merck、ダルムシュタット、ドイツ	F3777	FITC標識、ストック濃度に関する情報なし
針 0.4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, アメリカ	302200
ネオマウント	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	HX67590916
正常なヤギの血清	ジャクソン免疫研究所、ウェストグローブ、米国	005-000-121
ペニシリンストレプトマイシン	Gibco、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国	15140-122
ピペタス自動ピペット	Hirschmann Laborgeräte、エーバーシュタット、ドイツ	9907200
ProLong Gold 退色防止マウンタント DAPI付き	Invitrogen、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国	P36935
ウサギ抗マウスラミニンガンマ1鎖	Immundiagnostik、ベンスハイム、ドイツ	AP1001.1	在庫濃度に関する情報がありません
StemProアキュターゼ	Gibco、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国	A1105-01
滅菌処理メス(No.15)	MedWare、ナポリ、米国	120920
シリンジ1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, アメリカ合衆国	303172
シリンジ10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, アメリカ合衆国	309110
T75 滅菌細胞培養フラスコ	Sarstedt AG & Co., ニュンブレヒト, ドイツ	83,39,11,302

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