Mycobacterium bovis BCG上の標的抗原を提示するためのアビジン-ビオチン結合技術

要約

出典:Liao, T. A., et al., Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、Mycobacterium bovis BCGに抗原をロードして免疫原性を改善する技術を示しています。この方法では、アビジン-ビオチン系を使用して、細菌表面を外因性抗原でコーティングします。

プロトコル

1. BCG細胞表面のビオチン化

1. 10% OADC(オレイン酸、アルブミン、デキストロース溶液)と 0.05% Tween 80 を 37 °C で 37 °C の OD = 0.5-1.
   まで Middlebrook 7H9 ブロスで BCG を増殖させます 注:BCGはバイオセーフティレベル2の病原体であり、BCGに関するすべての実験は、適切な個人用保護具を備えたバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
2. 500 μL の氷冷エンドトキシンを含まない PBS と 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0) で^{10 個 9} BCG を 3 回洗浄します。BCGペレットを滅菌エンドトキシンフリーPBSに懸濁します。
3. 使用直前に、滅菌ろ過水に1 mLの10 mM Sulfo-NHS SSビオチンを調製します。​
   1. 0.5 mMのSulfo-NHS SSビオチン1 mLと細菌を室温で30分間インキュベー
   トします。
4. 標識した細菌を500 μLの冷たくしたPBSTで3回洗浄し、未反応のビオチン化試薬を除去します。
   1. ペレットを1mLのPBSTに再懸濁します。

2. ビオチン化BCG表面へのアビジン融合タンパク質のモノマー結合

1. 5 x 10⁸ビオチン化BCGとAviタンパク質(PBS-Tの最終10 μg/mL)をシェーカープラットフォーム上で室温で1時間混合します。
2. バクテリアを500μLの冷たくしたPBSTで3回洗浄します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エンドトキシンフリーRPMI 1640	StemCellテクノロジー	36750
スルホ-NHS SS ビオチン	サーモフィッシャー	21328
ミドルブルック7H9スープ	BD診断システム	271310
OADC	BD診断システム	B11886
トゥイーン 80	シグマ・アルドリッチ	P1379

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