脳腫瘍細胞に対する免疫療法戦略としてのβ-グルカンの試験分析のためのアッセイ

要約

出典: Folgado-Dorado, C. et al., Isolation and Purification of Fungal β-Glucan as an Immunotherapy Strategy for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2023)

このビデオは、β-グルカンを利用してミクログリア細胞を活性化し、活性酸素種であるスーパーオキシドラジカルを産生するin vitroアッセイを示しています。脳腫瘍細胞では、生成された反応性酸化剤が腫瘍細胞の増殖を積極的に抑制し、細胞死を誘導します。

プロトコル

β-グルカン誘導性ミクログリア刺激のin vitro研究

1. マウス膠芽腫およびミクログリア細胞の8ウェルチャンバースライドでの細胞培養

>注:このプロトコルは、GL261(膠芽腫)およびBV2(ミクログリア)細胞株に特異的です。しかし、わずかな変更を加えることで、これらのステップは他のがん細胞株や免疫細胞株の研究に使用できる可能性があります。

1. L-グルタミン、4.5 g / L D-グルコース、ピルビン酸なしで修飾されたダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)完全培地を準備します。ウシ胎児血清(FBS)の10%とペニシリン/ストレプトマイシン1%を追加します。.材料を37°Cのウォーターバスで15分間予温します。
2. 凍結したBV2およびGL261アリコートを水浴(37°C)で2分間解凍し、完全に解凍する直前に層流フードに運び、細胞を2つの異なる滅菌T25フラスコ(各細胞株に1つ)にプレートします。
3. T25フラスコを37°C、5%CO₂で培養物がコンフルエントになるまでインキュベートします
   手記： 凍結条件や凍結保存期間により、合流までの時間が異なる場合があります。これらの細胞株は、通常、T75フラスコでコンフルエントに達するまでに3〜5日かかります。
4. BV2細胞培養がコンフルエントになったら、8ウェルチャンバースライド0.6 x 10⁶細胞/ウェルに移します。8ウェルチャンバースライドをインキュベーターに24時間保管します。
5. ミクログリア細胞を8ウェルチャンバースライドに播種したら、GL261細胞で同じプロトコルを繰り返します。

2. β-グルカンによるミクログリアの活性化

1. BV2細胞を4種類のβ-グルカン(P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum、H. erinaceus)で0.2 mg/mLの濃度で72時間コーティングします。1つの実験条件は未処理のまま(通常の培地)ままでなければならず、対照群として機能します。
2. 72時間後に上清をピペットで収集し、残りの容量を0.20μmのシリンジフィルターに通します。次に、上清を-80°Cで少なくとも24時間凍結します。

3. GL261の活性化済みミクログリアコンディショニング培地による処理

1. GL261が8ウェルチャンバースライド内で80%コンフルエントになったら、最終容量濃度25%のβ-グルカン処理ミクログリア培地を72時間(総容量:250μl/ウェル)で追加します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
8ウェルチャンバースライド	サーモフィッシャー社(米国)	171080
ダルベッコの改良型イーグルのミディアム、Gluta MAXTM	Gibco、Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州、米国	10564011
エクステンダ(α-アミラーゼ/グルコアミラーゼ)	ノボザイムス(デンマーク
ウシ胎児血清	Gibco、Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州、米国	A4736301
リン酸緩衝生理食塩水	Gibco、Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州、米国	1010-015
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ、セントルイス	P4458
孵卵器	エッペドルフ	ギャラクシー170S

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