樹状細胞の高塩分処理法とマウスへの養子移植

要約

出典:Van Beusecum, J. P., et al. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-Presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、高塩分処理抗原提示樹状細胞(DC)をマウスに養子として移植する手順を示しています。マウスCD11c+樹状細胞(DC)は、ナトリウムを多く含む培地に曝露され、細胞内にイソレブグランジン(IsoLG)-タンパク質付加体を形成します。これらの付加物はネオアンチゲンとして機能し、DCの表面に存在します。高塩分処理された細胞は、養子細胞移植によってマウスに注入されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスからの脾臓の分離

1. 1640 RPMI(ロズウェルパークメモリアル研究所):10%ウシ胎児血清(FBS)、0.10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 μM β-メルカプトエタノール、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを準備します。
2. 10〜12週齢のC57bl / 6雄マウスを_CO2吸入により安楽死させます。マウスの胸部と側面に70%エタノールをスプレーします。左側で、皮膚と腹腔を慎重に開き、脾臓を露出させます。
3. 小さな鉗子を使用して、腸と肝臓をマウスの左側に慎重に移動させ、細いはさみを使用して、脾臓を穏やかに切除します
   手記： 胃腸管の損傷は汚染を誘発する可能性があるため、この手順は非常に慎重に行う必要があります。
4. 切除した各 ?? 臓を、3 mLのRPMI 1640培地を含むラベル付きの15 mL円錐チューブに入れます。.

2. 脾臓からの単細胞懸濁液の生成

>注:脾臓は、機械的解離と酵素的消化を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液に解離することができます。

1. 調製したRPMI 1640培地にコラゲナーゼD(1 mg/mL、凍結乾燥0.29 U/mg)およびDNase I(0.1 mg/mL)を加えて、脾臓消化液を調製します(ステップ1.1を参照)
2. 鉗子を使用して、脾臓を3mLの脾臓消化液が入ったCチューブ(解離チューブ)に移します。
3. メーカーの指示に従って、半自動ホモジナイザーを使用して機械的解離を行います。
   1. Cチューブを半自動ホモジナイザーに置き、Cチューブが回転アームにしっかりと配置されていることを確認します。Cチューブを配置したら、半自動ホモジナイザーのスタートボタンを押して、Spleen 04.01プロトコルを60 s.
      で実行します。 注:機械的解離は、50mLのコニカルチューブの上に40μmのフィルターを置き、フィルターを通して脾臓を穏やかに粉砕することによっても行うことができます。脾臓を粉砕した後、40μmフィルターを10mLのRPMI培地で洗い流します。
4. 機械的解離後、チューブをホモジナイザーから取り外し、酵素消化を行います。サンプルを連続回転(20 rpm)で37°Cで15分間インキュベートします。
5. 溶液を40 μmのストレーナーでろ過した後、50 mLのコニカルチューブにピペッティングして移します。40 μmのストレーナを10 mLのダルベッコPBS(dPBS)で洗浄します。細胞を300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
6. 遠心分離後、上清を完全に吸引し、ペレットを10 mLのdPBSに再懸濁して洗浄します。300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。

3. 脾臓単細胞懸濁液からのCD11c⁺ DCの単離

1. 細胞ペレットを5mLのdPBSに再懸濁し、血球計算盤とトリパンブルー排除を使用して細胞数をカウントします。
2. 細胞を300 x gで遠心分離し、4°Cで10分間ペレット
化します。
3. 上清を完全に吸引し、ペレットを400 μLの磁気活性化セルソーティング(MAC)バッファーに再懸濁します。
4. 1 x 10⁸細胞あたり100 μLのCD11cマイクロビーズ(材料表を参照)を添加します。
5. 細胞懸濁液をボルテックスし、4°Cの冷蔵庫で10分間インキュベー
トします。
6. 10 mLのMACバッファーを添加して細胞を洗浄します。300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
7. 上清を完全に吸引し、500 μLのMACバッファーに再懸濁します。

4. CD11c⁺ DCの磁気分離

>注:磁気分離は、LSカラムに装備された磁気セパレーター(材料の表を参照)を使用して手動で行われます。磁気分離は、自動磁気分離器を使用して自動的に行うこともできます。(資料の表を参照)。

1. LSカラムをMACセパレーターの磁場に置き、各カラムの下に15 mLの円錐チューブを配置してフロースルーを収集します。
2. LSカラムを3 mLのバッファーですすいでください。
3. 細胞懸濁液を各LSカラムに置き、標識されていない細胞を含むフロースルーを回収します。
4. LSカラムを3 mLのMACバッファーで洗浄し、通過する非標識細胞を回収します。LSカラムをさらに2回洗浄します。
5. LSカラムをマグネティックセパレーターから取り外します。各カラムに5 mLのMACsバッファーを添加し、LSカラムを清潔な15 mLコニカルチューブにしっかりと浸して、磁気標識細胞をすぐに洗い流します><。 手記：高純度の細胞懸濁液を得るためには、CD11c細胞を二重に単離することが重要です。したがって、手順 3.1 から 4.5 を繰り返します。純度標準については図4を参照してください。このステップにより、CD11c⁺細胞の純度が90〜95%に向上します。
6. トリパンブルー排除を使用して、血球計算盤でCD11c ⁺ DC数を決定します。細胞サンプルを0.4%トリパンブルー溶液で1:1に希釈します
   注:生細胞は青色に染色されますが、生細胞は染色されません。
   1. これを行うには、血球計算盤に希釈した細胞サンプル10μLを慎重に充填し、1分間インキュベートします。
   2. ロードされたチャンバー内の1 x 1 mm²の4つの正方形の細胞を数え、生細胞数を決定します。

>5. CD11c⁺ DCのin vitro高塩処理

1. 10% FBS、0.1 mM HEPES、1 mM ピルビン酸ナトリウム、50 μM β-メルカプトエタノール、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを 500 mL 1640 RPMI に添加して、DC 培地を調製します。
2. 1.17 gのNaClを秤量し、滅菌済みの50 mLファルコンチューブに入れて、10x DC高塩細胞培養培地(400 mM)を調製します。50 mLの滅菌DC細胞培養培地(ステップ5.1で調製)を50 mLのファルコンチューブに加え、NaClが溶液中になるまでボルテックスします。
3. 高塩率DC培地を直ちに、細胞培養フード内の0.2 μmフィルターによる真空ろ過を使用して
ろ過します。
4. 脾臓から各細胞懸濁液を300 x gで10分間、4°Cで遠心分離し、各細胞ペレットをDC培養培地に1 x 10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁します。
5. 900 μL(約1 x 10⁶セル)のDC懸濁液を24ウェル平底Falconプレートにピペットで入れます。各ウェルに100 μLの高塩DC培地を添加すると、最終的なナトリウム濃度が190 mMになります。プレートにラベルを付け、37°Cの加湿CO₂インキュベーターに48時間置く。

6. 高塩処理CD11c⁺ DCの養子移管

1. in vitro 刺激を 48 時間行った後、プレートを 37 °C の加温 CO₂ インキュベーターから取り出します。
2. 細胞培養培地を上下にピペットで動かして、CD11c⁺ DCを再懸濁します。すべてのCD11c⁺ DC懸濁液を対応する標識1.6mLチューブにピペットで移します。ウェルプレーティングされた個々のウェルごとにこの手順を繰り返します。
3. 各CD11c⁺ DC懸濁液を300 x gで4°Cで10分間遠心分離します。DCペレットを100μLの滅菌dPBSで再懸濁します。
4. DC懸濁液を27G1/2インチの針を備えた1mLシリンジに引き込みます。
5. ナイーブなオスの10週齢C57bl/6マウスを2%イソフルランの下に置き、安定した手術面を実現します。ペダル反射の欠如で麻酔のレベルを確認してください。安定した手術面が達成されたら、針を約30°の角度でゆっくりと慎重に後眼窩空間に導入します
   手記： 27G針の斜角は、眼の損傷を防ぐために、目から離れて下を向いている必要があります。
6. CD11c⁺ DC懸濁液(約1 x 10⁶細胞)をゆっくりと滑らかに注入します。注入が完了したら、眼窩後腔から針を慎重に取り外し、目を傷つけないように意識します
   手記：注射後、出血はほとんどまたはまったくないはずです。CD11c⁺ DCの養子移植は、静脈内注射法(尾静脈など)を使用して行うこともできます。対照マウスは、通常の塩培地で培養したCD11c⁺ DCを投与されました。
7. マウスをノーズコーンから取り出し、麻酔からの回復中に約30分間監視します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
APC/Cy7抗マウスCD11c	バイオレジェンド	117324
autoMACS 実行バッファ	ミルテニーバイオテック	〒130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure (ウルトラピュア)	ミルテニーバイオテック	130-108-338
コラゲナーゼD	ロシュ	11088866001
DNase I	ロシュ	10104159001
カルシウムとマグネシウムを含まないdPBS	コーニング	21-031-履歴書
FcRブロッキング試薬	ミルテニーバイオテック	〒130-092-575
FITC抗マウスCD45	バイオレジェンド	103108
ジェントルMACS Cチューブ	ミルテニーバイオテック	〒130-096-334
GentleMACS解離装置	ミルテニーバイオテック	〒130-093-235	使用プロトコル:脾臓04.01
LIVE/DEAD修正可能なバイオレットデッドセルステインキット	インビトゲン	L34964
LSカラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-401
QuadroMAC セパレータ	ミルテニーバイオテック	〒130-090-976
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11835-030