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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>1. NIT-1細胞株のエンジニアリングとメンテナンス
- 非肥満糖尿病(NOD)マウスと遺伝的背景を共有するNIT-1細胞株、および4.5 g/Lグルコースを含むダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)の組織培養皿中の293FT細胞を、5% CO2を含む37°Cインキュベーターで
維持します。
- トランスフェクションのために、293FT細胞を70%〜80%のコンフルエンスに増殖させます。
- 293FT細胞の10cmディッシュあたり、構成的に活性なEF1αプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ導入遺伝子(luc2)を発現する10μgのpLenti-luciferase-blast(補足ファイル1を参照)、パッケージングプラスミドpMD2.G、pMDLg/pRRE、およびpRSV-Revの各2μg、エンベロープタンパク質プラスミドpCMV-VSV-Gの4μgを組み合わせます。 60 μgの線状ポリエチレンイミン(PEI)を1 mLの無血清DMEMに添加します。トランスフェクションする細胞の数に基づいて量を調整します。
- DNA、PEI、およびDMEMを室温(RT)で20分間放置し、293FT細胞に加えます。
- トランスフェクションの48時間後にレンチウイルス粒子を含む培地を回収します。
- NIT-1細胞を~80%のコンフルエント度で、レンチウイルス粒子を含む培地1 mLを10 6細胞あたり48〜72時間形質導入します。
- ルシフェラーゼ発現細胞を5 μg/mLブラストシジンで48時間選択してください。
- さらに、ルシフェラーゼ発現細胞を実験問題に適合するように遺伝子改変します。比較のために、ルシフェラーゼ発現野生型または非標的制御細胞株を含めます。
手記：標的遺伝子修飾の例としては、クラスター化規則的な間隔を空けた短い回文反復回数(CRISPR)ノックアウト、CRISPRa/i、shRNAノックダウン、過剰発現などがあります。
2. 移植用NIT-1細胞の調製
- ルシフェラーゼ発現細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで増殖させます。
- 増殖培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10 cm皿に5 mL)で細胞を洗浄します。
- 0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(トリプシン-EDTA)1mLを各ディッシュに2分間加えます。.
- トリプシンを5mLの成長培地で中和します。
- ピペットを使用して皿から細胞を洗い流し、円錐形のチューブに移します
手記：同じ細胞株の複数の皿からの細胞を組み合わせることができます。
- トリパンブルーなどの染色剤を使用して細胞をカウントし、血球計算盤で手動で、または自動セルカウンターで自動的に
カウントします。
- 250 × gでRTで5分間遠心分離し、吸引ピペットで上清を除去します。
- 細胞ペレットを5×107細胞/ mLの濃度でPBSに再懸濁します(マウスあたり細胞株あたり107細胞を200 μLの容量で移植します)。
- 移植まで細胞を氷上(最大3時間)に保ちます。
3. 非肥満糖尿病重症複合免疫不全症(NOD-scid)マウスへのNIT-1細胞の移植
- レシピエントマウス(脾細胞の単離に使用されたマウスと同じ性別の8〜10週齢のNOD-scidマウス)をノックダウンチャンバーでのイソフルラン吸入により麻酔します。2.5%イソフルランを1.5 L/minの流量と9 L/minの排気速度でチャンバーに送達します。
- 乾燥を防ぐために、動物の目を眼科用軟膏で滑らかにします。
- ガード付きの電気シェーバーを使用して、マウスの背中(背側)から毛を取り除き、皮膚を露出させます。剃毛移植領域は約 1 インチ x 2 インチになります。剃毛したマウスを移植までノックダウンチャンバーに戻します。
- マウスを一度に1つずつ、イソフルランノーズコーンのあるきれいな表面に移します。マウスの頭をノーズコーンにそっと導きます。移植中の麻酔を維持するために、0.25 L / minのイソフルラン流量を使用してください。
- イソプロピルアルコール調製パッドで移植領域を拭いて、抜け毛を取り除き、皮膚を消毒します。
- シリンジをロードする前に、細胞が完全に再懸濁されていることを確認してください。26Gの針が付いた1mLの滅菌シリンジに、過剰な量の細胞(>300μL)を吸い込みます。気泡があれば取り除きます。次に、余分な細胞をチューブに戻して、300 μLの細胞懸濁液がシリンジに残るようにします。
- 利き手ではない手に持たれた一対の湾曲した鉗子を使用して、マウスの背中の片側(左または右)の皮膚をそっと持ち上げて、皮下スペースに簡単にアクセスできるようにします。
- 利き手を使用して、シリンジをマウスの体の冠状面と矢状面と平行に配置します。針をマウスの頭部に向けて、針を後肢近くの皮膚に挿入し、皮下腔に優しく導きます。針全体が皮膚の下に残り、突き出さないようにしてください。
- 鉗子を調整して、針の付け根の周りの皮膚をやさしく保持します。少量の細胞懸濁液(<50μL)をゆっくりと分注し、注射部位の皮下に小さな膨らみが形成されることを確認します。200μLが皮下腔に送達されるまで、細胞懸濁液を注入し続けます。
- 鉗子を所定の位置に保持し、針をマウスの体と平行に保ちながら、針をゆっくりと引き抜きます。針を抜いた後、穿刺傷から細胞が漏れないように、鉗子で皮膚を数秒間閉じたままにします。
- 遺伝子改変が評価されている場合は、マウスの反対側で別の注射器を使用して移植を繰り返し、変異細胞と制御細胞の両方が各マウスに注入され、一方の細胞株が左側に、もう一方の細胞株が右側にいます。1つの細胞株のみを移植する場合は、細胞を片側のみに注入します。
- 移植後、各マウスを新しいケージに移します。ケージにマウスを追加する前に、各マウスが麻酔から完全に回復するのを待ちます。
手記：マウスは、通常の活動を再開し、嗜眠や運動障害の兆候を示さなくなったときに回復します。
- 移植後の実験期間中、マウスの健康状態を毎日評価します。移植片が大きな膨らみを形成するか、マウスが衰弱して無気力になった場合は、血糖値を測定し、すべての低血糖マウスに10%(w / w)のショ糖水を自由に供給します。.すべての獣医の推奨事項に従い、施設のガイドラインに従って体調不良が続いているマウスを安楽死させます。この研究では、マウスをCO2吸入とそれに続く頸部脱臼によって安楽死させました。
4. 自己反応性脾細胞の単離と精製
- 尿(または血液)グルコーステストストリップを使用して、最近発症した(10日未満)糖尿病の10〜16週齢のオスまたはメスのNODマウスを特定します。NODマウスは、尿/血糖値が少なくとも2日連続で250 mg/dL≥の場合、糖尿病と見なされます。
手記：NOD-scidマウス1匹につき、1,000万個の脾細胞が必要です。1つの脾臓は通常、5000万から1億5000万の脾細胞を産出します。脾細胞は、センチナルモニター施設に収容された病原体のないマウスから単離されました。
- 適切な数の糖尿病性NODマウスを安楽死させます.
手記：この研究では、マウスをCO2吸入とそれに続く頸部脱臼によって安楽死させ、死を確実にしました。
- マウスを背にして、手術用ハサミで皮膚に長さ約2インチの垂直切開を行います。研究者の視点からマウスの右側を開き、真っ赤な脾臓を見つけます。ピンクの膵臓から脾臓をそっと切り取り、5mLの滅菌PBSを含む滅菌10cmのペトリ皿に移します。必要な数のマウスで解剖を繰り返します。
手記：複数のマウスの脾臓を1つの皿にまとめることができます。滅菌フード内の滅菌試薬と機器を使用して、次の手順を実行します。
- 滅菌シリンジプランジャーの平らな上部で脾臓をつぶします。
- 40 μmまたは70 μmのストレーナを50 mLのコニカルチューブに入れ、5 mLのPBSでストレーナーを洗浄してプライミングします。脾臓懸濁液をストレーナーに移し、ストレーナーを通して穏やかにマッシュし続けます。10mLのPBSで皿を洗い、洗ったものをストレーナーに移します。ストレーナーから赤い色がなくなるまでマッシュを続けます。
- ストレーナを捨て、チューブを500 × gでRTで5分間回転させ、吸引ピペットで上清を取り除きます。
- RTに予熱したACK溶解緩衝液5mL(最大3つの脾臓用)に細胞ペレットを再懸濁し、赤血球を4分間溶解します。
- 溶解バッファー5 mLあたり5 mLのNIT-1細胞培地(上記)で反応を停止します。細胞懸濁液を新しいストレーナーに通して、塊を取り除きます。ストレーナを捨て、RTで500 × gで5分間回転させます。
- 細胞ペレットを20mLのPBSに再懸濁し、細胞をカウントします。室温で500 × gで5分間遠心し、1.5 mLのセーフロック反応チューブに1 × 108細胞/mL(注入量は0.1 mL/マウス)の濃度で無菌PBSに細胞を再懸濁します。
- 細胞を氷上(1時間以内)に保管するか、細胞をRTに保ち、すぐに尾静脈注射に進みます。
5. 側尾静脈を介した糖尿病性脾細胞の静脈注射
- 成人のレシピエントNOD-scidマウスの体を温め(例:ヒートランプを5~10分間使用)、静脈を血管拡張します(これは視覚化と静脈への注射に役立ちます)
手記：マウスの過熱を避けるために、この時間を超えないようにしてください。常にヘルス ステータスを監視します。マウスが疲れている、または動かないように見える場合は、すぐにヒートランプをオフにしてください。
- 細胞懸濁液を温めます。滅菌針(27-30 G、0.3 mm / 0.5インチ以下)で滅菌シリンジ(0.3-1.0 mL)を準備するか、0.3 mm(0.5インチ)針付きの滅菌0.5 mLインスリンシリンジを使用します。.針は常に滅菌状態に保ち、注射の合間にシリンジを下ろす必要がある場合は滅菌トレイを使用してください。.
- 各注射の前に脾細胞溶液を再懸濁してください。各マウスについて、予熱して混合した脾細胞懸濁液100μLをシリンジに引き込みます。シリンジまたは懸濁液に気泡が存在しないことを確認してください.
手記：マウスを拘束装置に入れる前に、すべての機器と備品(消毒用のアルコールワイプ、注射する脾細胞を充填した注射器、注射したマウスを分離するための新しいケージ)を準備してください。
- マウスを拘束装置に置きます。利き手ではない手で尾を捕らえ、2つの外側の尾脈のうちの1つを見つけます。必要に応じてテールをゆっくりと回転させます。消毒用ワイプ(70%イソプロピルアルコール)で尾を拭くと、皮膚がきれいになり、静脈の視認性が向上します。
- 利き手で針を尾の中央領域に鋭角に挿入します。針の斜角を上にして、針を皮膚に数ミリスライドさせます。
手記：針が静脈と平行で、皮膚の少し下に配置されていることを確認してください。皮膚/血管壁を貫通した直後のマウス/尾の突然の動きに備えてください。針の挿入が成功すると、静脈に「スムーズにスライド」したように感じるはずです。もう一度試みる必要がある場合は、尾を体に向かってさらに上に移動します。
- シリンジに穏やかな圧力を加えて、脾細胞懸濁液を注入します。注射するときは、針がさらに内側または外側に移動しないようにしてください。成功した注射は、注射中に背圧を感じることなく滑らかで、注射直後の透明な/白い血流によって示されます。
- 針を静脈からそっと外し、出血が止まるまで消毒ワイプで尾に軽い圧力をかけます。マウスを拘束装置から離し、新しく準備したケージにそっと移します。
手記：NIT-1細胞移植を受けていない対照マウスに2〜3匹を脾細胞に注射し、自己反応性脾細胞が糖尿病を誘発する可能性を確認しますが、これは注射後約2〜4週間かかります。
6. NIT-1グラフトの生体内発光イメージング
>注:移植片を週に1〜2回イメージしてください。移植当日は、移植片が沈殿し、安定したルシフェラーゼ発現を確保するために、移植後少なくとも2時間待ちます。時間が制限要因である場合は、代わりに 1 日目に初期測定を行うことができます。推奨される初期イメージング スケジュールは、注射後 0 日目または 1 日目、5 日目、10 日目、14 日目、18 日目、および 25 日目です。ただし、生体発光シグナルの喪失によって判断される自己免疫の進行に基づいてスケジュールを調整してください。
- ダルベッコのPBSで15 mg / mL D-ルシフェリン溶液を調製します。.RTで撹拌して溶解し、滅菌フィルター(0.22μm)を洗浄します。1 mLのアリコートを-20°Cで保存し、必要に応じて解凍します><。
手記：アリコートは再冷凍できます。
- イメージングの少なくとも5分前に、1 mLシリンジと26 G針を使用してマウスを腹腔内に注入し、150 mg / kgの用量でD-ルシフェリン溶液を注入します
手記：各マウスに新しい注射器と針を使用します。
- 施設のガイドラインに従って、イソフルラン吸入によってマウスを麻酔します。推奨条件は、ノックダウンチャンバーへの流速が1.5 L / min、排気速度が9 L / minの2.5%イソフルランです。
- 乾燥を防ぐために、動物の目を眼科用軟膏で滑らかにします。
- イメージング機器に関連付けられているソフトウェアを開きます。新しいユーザーを作成するか、ログインします。右下のコントロールパネルで、[初期化]を選択します(図1A)。イメージングデータを自動保存するには、コンピューター上に適切なフォルダーを作成し、[取得] |[Auto-save to...](自動保存先) (図 1A)。装置の初期化が完了したら、露光時間を1分に設定します。
手記：完全なイメージングパラメータを図1Bに示します。
- マウスをノックダウンチャンバーからイメージング機器に一度に1つずつ移します。手足を広げてマウスを腹に置き、頭を鼻円錐にそっと導きます。ノーズコーンを介して供給される0.25L/minのイソフルラン流量は、イメージング中の麻酔を維持するのに適しています。マウスの背面の中央を両手で押してから、手を外側に広げて離して、マウスをそっと平らにします。
- [取得] を選択します (図 1B)。実験の関連する詳細をポップアップウィンドウ(図1C)に記録します。
手記：図2Aには、さまざまな時点で2つの移植片を移植した3匹の8週齢の雌NOD-scidマウスの代表的な画像があります。
